Полная версия

Главная arrow География arrow БИОХИМИЯ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Электрофорез. Определение электрического заряда аминокислот методом электрофореза на бумаге

Суть метода заключается в том, что если частица с зарядом q находится в непроводящей среде в электрическом поле Е, она будет двигаться с постоянной скоростью v, определяемой соотношением между электрической силой Eq и силой сопротивления вязкой среды Jv, где/- коэффициент трения. Отсюда

Подвижность и определяется как скорость на единицу напряженности электрического поля, или

Подвижность зависит от коэффициента трения f который является функцией некоторых физических параметров молекул. Поэтому значение и дает информацию о величине и форме молекулы. Однако данные электрофореза не могут являться детальной информацией о макромолекулярной структуре исследуемых частиц, так как на движение частиц под действием электрического поля большое влияние оказывает среда, в которой осуществляется движение.

Существуют следующие основные типы электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.

Электрофорез с подвижной границей - сравнительно редко используемый метод, является аналитическим и пригодным в основном для анализа белков.

Зональный электрофорез используют в качестве аналитической и препаративной методики. Аналитическая методика заключается в определении состава или степени чистоты образца (смесь аминокислот, белков или других несущих заряд частиц). Препаративная заключается в разделении различных аминокислот.

Непрерывный электрофорез - препаративная методика, используемая для разделения не только аминокислот, но и других биогенных молекул (белков, ДНК, РНК и других амфолитов).

Электрофорез на бумаге относится к зональному электрофорезу, так как исследуемый образец наносится в виде небольшой зоны. Данный метод является наиболее простым методом разделения аминокислот и заключается в том, что очень небольшое количество раствора (капля), содержащего смесь аминокислот, наносят на центральную часть полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанной буфером с определенным pH, и прикладывают к концам полоски напряжение, создающее электрическое поле. Аминокислоты в зависимости от знака заряда под действием напряжения перемещаются по полоске в ту или другую сторону. При этом скорость движения аминокислоты будет зависеть от величины ее суммарного заряда. Через определенное время напряжение снимают, полоску высушивают и для проявления расположения аминокислот спрыскивают «проявителем», например нингидрином (2,2-дигидрокси- 1,3-индандион), который взаимодействует с аминокислотами при слабом нагревании с образованием окрашенных соединений (лиловое и синее окрашивание) (химическую реакцию см. ниже в разделе «Характерные химические реакции аминокислот», рис. 3.5). Схема электрофореза на бумаге приведена на рис. 3.2. Полоска фильтровальной бумаги с разделенными аминокислотами называется электрофореграммой.

Схема электрофореза на бумаге

Рис. 3.2. Схема электрофореза на бумаге

Если требуется количественное определение, вещество из исследуемого образца можно элюировать (вымывать) и определять спектрофотометрически.

Многие биомолекулы адсорбируются на бумаге (ацетате целлюлозы), что препятствует движению и тем самым получению четких результатов анализа. Явление адсорбции на бумаге характерно для крупных молекул, таких как белки, поэтому для электрофореза макромолекул применяют другие носители, например мембраны из ацетата целлюлозы или гели из крахмала, агарозы и т. п.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>