Полная версия

Главная arrow География arrow БИОХИМИЯ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Методы выделения и анализа белков

Изучение химической структуры белков начинается с их гидролиза. Выделенные из органов и тканей белки гидролизуются в

  • 6.. .12N H2S04 или НС1 в течение 6...20 ч при 100...ПО °С. В этих условиях белки распадаются с образованием аминокислот. Однако при кислотном гидролизе разрушаются триптофан, частично серин и треонин. Для предохранения этих аминокислот от разрушения прибегают к гидролизу белков в 2N щелочи при
  • 100.. . 110 °С. В свою очередь, щелочной гидролиз разрушает и ряд других аминокислот (аргинин, цистин, серин и треонин), а также приводит к рацемизации (потере оптической активности) аминокислот.

Более надежный метод, позаимствованный у живой природы, - гидролиз с помощью протеолитических ферментов. В организме расщепление белка катализируется ферментами - протеазами. Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря присущей им во многих случаях специфичности. Например, фермент трипсин расщепляет только те пептидные связи, у которых карбонильная группа принадлежит одной из основных аминокислот (лизину, аргинину) (табл. 3.4).

Таблица 3.4

Сведения о свойствах наиболее важных протеолитических ферментов

Протеаза

Место синтеза

Оптимум pH

Специфичность (атакуемые связи)

Пепсин

Желудок

1,5...2,5

... R-Phe ... R-Туг ... Leu - Gin ... Leu - Val

Трипсин

Поджелудочная

железа

7,5...8,5

... Arg - R ... Lys-R

Химотрипсин

Поджелудочная

железа

7,5...8,5

... Tyr-R ... Phe-R

Комбинируя методы кислотного, щелочного и ферментативного гидролиза, с помощью различных методов анализа аминокислот можно установить аминокислотную последовательность белка.

Аминокислотную последовательность белка принято обозначать цепью из трехбуквенных или однобуквенных символов соответствующих аминокислот. Первым природным полипептидом, чья аминокислотная последовательность была установлена, стал инсулин:

Наличие ионизированных групп в боковых цепях полипептида обусловливает электролитную природу белков. Доля ионизированных концевых групп полипептидной цепи черезвычайно мала. Степень ионизации боковых групп зависит от pH среды. Значение pH, при котором белковая молекула имеет одинаковое число положительных и отрицательных ионизированных групп, носит название изоэлектрической точки белка (ИЭТ). В ИЭТ растворимость белка минимальна; белок остается неподвижным в электрическом поле постоянного тока. Каждый индивидуальный белок характеризуется своим значением ИЭТ.

При добавлении водородных ионов снижается pH среды, и белок вследствие подавления диссоциации карбоксильных групп находится в форме катиона. При добавлении щелочи повышается pH, заряд белковой молекулы меняется на отрицательный и молекула белка становится анионом. Таким образом, белки относятся к полиамфолитам.

Титрование. Метод титрования, описанный в гл. 2 как способ определения рКа слабых кислот, оснований и аминокислот, используется также как метод идентификации и определения изо- электрических точек белков.

Графическая зависимость величины pH среды от количества добавленных кислоты или щелочи (ионов Н+ или ОН-) называется кривой титрования белка. Для каждого белка кривая титрования индивидуальна и зависит от набора и количества в составе белка аминокислотных радикалов и значений их рКа. Буферная емкость белков зависит от количества имеющихся одинаково ионизирующих функциональных групп аминокислотных радикалов. На базе кривых титрования разработаны аминокислотные анализаторы pH, с помощью которых проводится анализ биологических жидкостей на содержание различных аминокислот.

Для того чтобы провести анализ биологической жидкости на содержание различных аминокислот, необходимо знать значение их рКа.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>