Конструирование рекомбинантных ДНК

Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. На матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ДНК (кДНК) или из клонотеки (библиотека клонов — коллекция клонов) выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации — удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Ген встраивают в специальный вектор для экспрессии, содержащий различные регуляторные элементы (промоторы, терминаторы и др.), которые обеспечивают экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в клетку.

Промоторы — последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК- полимеразы. Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического, только в прокариотическом организме. В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но если в растительную клетку переносится бактериальный ген, то его прокариотический промотор должен быть заменен соответствующим эукариотическим. Для растений часто используют промоторы от растительных вирусов, которые эволюци- онно приспособлены работать в растительной клетке.

Промотор может быть сильным и слабым. Сильный промотор инициирует синтез мРНК часто, слабый — гораздо реже. При этом очень важно при конструировании вектора не изменить последовательность оснований промотора, которая определяет частоту инициации синтеза мРНК. Замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.

Регуляторные промоторные системы подразделяются на:

• а) конститутивные — действующие во всех тканях организма. К наиболее сильным конститутивным промоторам для экспрессии в растениях относится 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (рЗББВМЦК — p35SCaMV). Он функционирует во всех растительных тканях в течение всей жизни растения;
• б) специфические — действующие в определенных тканях или классах растений или животных. Например, промоторы, контролирующие экспрессию в клетках на определенных стадиях роста и развития растения или работающие только в фотосинтезирующих тканях (промотор гена малой субъединицы фотосинтетического фермента рибулозо-бисфосфат- карбоксилазы [рРБФК]). Для экспрессии чужеродных генов в однодольных могут использоваться промоторы Ubil кукурузы и Actl риса;
• в) индуцибельные — работающие при определенных условиях: температуры, освещения, концентрации фитогормонов и т.д., например, салицилат-индуцируемый промотор, промотор эндопептидазы, промотор теплового шока сои. Такие промоторы используются в тех случаях, когда исследователь ставит задачи достичь тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях) и времени (в определенный период развития). Многие из таких промоторов достаточно универсальны, например, некоторые промоторы генов теплового шока. В частности, промотор гена hsp70 из дрозофилы равно эффективен и в клетках растений. Особый интерес представляют промоторы, индуцируемые низкомолекулярными химическими эффекторами, часто не свойственными растениям. В зависимости от типа промотора, индукторами могут служить тетрациклин, дексаметазон, бензотиадиазол, этанол, ионы меди и другие соединения. Эти промоторы очень важны для фундаментальных исследований трансгенных растений, позволяя четко дифференцировать первичные и вторичные эффекты изучаемого гена и тем самым прояснить его истинную биологическую функцию. Они перспективны также для биотехнологии, так как позволяют вызвать экспрессию гена в заданный период, когда она уже либо не препятствует нормальному росту и развитию растения, либо не вызывает иных отрицательных последствий.

Регулируемые извне индуцибельные промоторы, контролирующие соответствующие гены, могут способствовать одновременному прохождению растениями основных стадий онтогенеза (переход к цветению, опадение листьев и др.), что важно для практики сельского хозяйства. Существует промотор, индуцирующийся при механическом стрессе (поранении) или при обработке растений элиситорами. Использование такого промотора, соединенного с целевым геном, дает возможность выращивать трансгенные растения как обычные вплоть до стадии уборки урожая, а далее срезка растений индуцирует экспрессию целевого гена, продукт которого накапливается в собранной биомассе.

Терминаторы. В векторе должна также обязательно присутствовать терминаторная нуклеотидная последовательность, расположенная на З’-конце трансгена. Добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания. При концевом добавлении сравнительно коротких (>300 п.н.) участков связывания ядерного матрикса (МАР) трансген имеет больше шансов образовать независимую петлю хроматина или включиться в состав транскрибируемого эухроматина. В обоих случаях это приводит к повышению и стабилизации уровня экспрессии трансгена. Для растений часто используется терминаторная последовательность гена нопалин-синтазы из Agrobacterium tumefaciens.

Другие элементы. Кроме промотора, экспрессию чужеродных генов могут усиливать другие элементы, например, модуляторы, а также энхансерные последовательности, действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК. Они расположены на расстоянии от одного до нескольких сотен нуклеотидов до промотора.

Схема конструирования рекомбинантных плазмид. Никакого единого, универсального набора методик по конструированию рекомбинантных плазмид не существует, но чаще всего их проводят по следующей схеме:

• 1) из организма — донора нужных генов — экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК);
• 2) подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор-встроенная ДНК»).

Создание векторов на основе Ti-плазмид. Неонкогенные векторы на основе плазмид агробактерий бывают 2-х типов: цис или транс, в зависимости от того, находится ли Т-ДНК на том же репликоне, что и vtr-гены, или на отдельной плазмиде.

В первом случае (цис-действующие vir-гены) вектор называют коинтегративным, а во втором случае при использовании трансдействующих vir-генов, его называют бинарным.

Бинарные векторы конструируют на основе плазмид, содержащих последовательности границ Т-ДНК и способных реплицироваться как в Е. coli, так и в агробактерии, поскольку содержат сайты инициации репликации (ori) и для Е. coli, и для A. tumefaciens. Эти векторы устроены таким образом, чтобы последовательности границ фланкировали множественные сайты для клонирования, позволяющие осуществить вставку чужеродной ДНК, и маркеры, обеспечивающие прямую селекцию трансформированных растительных клеток. Бинарные векторы варьируют по размерам, стабильности репликации в агробактериях, наличию рестрикционных сайтов для встраивания чужеродной ДНК, наличию маркерных генов для селекции трансформированных растений и селекции трансконъюгатов.

Для получения коинтегративного вектора используют плазмиду- помощницу, которая способна реплицироваться в Е. coli Чужеродные гены клонируют в ней, а затем путем рекомбинации между соответствующим штаммом агробактерии и Е. coli создают коинтегративный вектор.

Оба вектора несут селективный маркерный ген, который используется либо в Е. coli, либо в A. tumefaciens, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П), растительный селективный маркерный ген, ген, который нужно ввести в геном, и фрагмент Ti-плазмиды, гомологичный участку ДНК неонкогенной Ti-плазмиды.