Полная версия

Главная arrow География arrow БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Введение в клетку чужеродной ДНК

При введении чужеродной ДНК различают процессы трансформации и трансфекции. Трансформацией называется процесс введения вектора в клетку, вызывающий в ней наследственные изменения. Трансфекцией называется процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, не приводящий к наследственным изменениям в клетке.

Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку низкая. Из каждых 104—105 плазмид в клетки попадает только одна. Поэтому среди клеток, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. При высеве всех клеток на селективную среду, содержащую какие-либо специальные добавки (в основном антибиотики), только клетки, содержащие встроенные гены, начинают делиться и образуют колонии, которые называются клоном, а сам процесс клонированием. Отбор по определенному биологическому признаку, в частности по устойчивости к антибиотику, называется селекцией.

В настоящее время применяются 2 основные группы методов переноса ДНК в клетки растений: прямые и агробактериальные.

Прямой перенос ДНК в растительную клетку

При этом способе используются различные методы: электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилового спирта или ионов Са, и высокого pH. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако в некоторых случаях без них никак не обойтись.

В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, поливинилового спирта или ионов Са и высокого pH) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты — клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань растворенными в осмотике ферментами, разрушающими пектин и целлюлозу — пектиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются или многоатомные спирты (ман- нитол или сорбитол) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после «переваривания» клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых в дальнейшем могут образоваться трансформированные растения-регенеранты.

Электропорация — основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200—350 В, длительность импульса 30—60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, ионов Са и высокого pH. Раствор ПЭГ добавляют к суспензии протопластов, смешенных с плазмидой и инкубируют в течение 20—30 мин. При другом способе в суспензию протопластов в растворе СаС12 добавляют щелочь, создавая pH 10—12, и выдерживают в этих условиях 15—20 мин. После таких обработок протопласты отмывают центрифугированием и высевают на питательные среды.

ПЭГ и ионы Са воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза — формирования пузырьков, окруженных липидной мембраной, в которых находятся молекулы ДНК. В клетке липидная оболочка растворяется и ДНК встраивается в геном клетки.

Трансформация с помощью биологической баллистики (/ биолистики / бомбардировки). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов (из прямых) трансформации растений, особенно однодольных растений. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6—1,2 мкм, прикрепляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносят на пластиковую пулю и помещают внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10—15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органель- ные геномы, чего не удается осуществить другими методами.

Трансформация микроинъекцией. При этом способе каждый отдельный протопласт прикрепляют на специальную подложку и с помощью супертонкой стеклянной иглы впрыскивают в него векторную ДНК. Затем протопласты отделяют от подложки и помещают в питательную среду, где они после образования клеточной стенки могут делиться, образуя микрокаллусы, из которых в дальнейшем может регенерировать растение. Метод в настоящее время почти не используется из-за большой трудоемкости.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>