Полная версия

Главная arrow География arrow БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Перенос ДНК с помощью агробактерий

Другая, наиболее распространенная группа методов—трансформация с помощью A. tumefaciens или A. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri.

Трансформация in vitro. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования эксплантов в течение некоторого времени (обычно 2—3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation), а затем экспланты переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий. Экспланты, используемые в таких экспериментах по трансформации, могут быть двух видов: большими гетерогенными или малыми гомогенными. Большие экспланты — это, как правило, участки органов, содержащих огромное число клеток: листья и стебли, сегменты гипокотилей и семядольные листья проростков, соцветия и различные части цветка, сегменты корней. Малые экспланты — микроспоры и проэмбрио, а также одиночные клетки, образовавшиеся из протопластов.

Этот метод достаточно универсален и пригоден для многих видов растений, хорошо образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени получено большинство трансгенных растений различных генотипов. Однако сложностей хватает и при использовании агробак- териальной трансформации. Основными трудностями являются — отсутствие универсальных методов переноса генов в клетку, сложность получения соответствующих систем культуры тканей и регенерации растений, необходимость подбора соответствующего штамма агробактерии. Успех получения трансгенных растений зависит от множества факторов, поэтому в каждом конкретном случае приходится подбирать строго индивидуальные условия для каждого генотипа растения.

Трансформация in planta. Агробактериальную трансформацию можно проводить, инфицируя растения через поранение ткани каким- либо острым инструментом, на котором находятся агробактерии, например, уколов препаровальной иглой апикальную меристему проростка или пазушную почку растения. Побег, выросший из такой почки, затем срезают и высаживают на селективную среду, чтобы отобрать трансформированные растения.

Другой способ трансформации in planta — через нанесение суспензии агробактерий с активированными vir-генами на пестики цветков растений с последующим опылением пыльцой, собранной с других растений того же сорта. Так можно трансформировать, например, кукурузу или любое другое растение, имеющее достаточно большой пестик. В некоторых случаях проводят предварительную трансформацию пыльцевых зерен с дальнейшим опылением цветков. Для растений арабидопсиса, имеющих очень маленькие цветки, разработан метод трансформации путем опускания нераскрывшихся цветочных бутонов в агробактериальную суспензию. Дальнейший отбор трансформированных растений проводят, высевая образовавшиеся после трансформации семена в селективных условиях. Метод трансформации in planta имеет преимущество перед классической процедурой трансформации, поскольку при этом можно избежать некоторых стадий культивирования тканей и последующей регенерации. Однако этот метод очень трудоёмок, т.к. частота трансформации при его использовании очень мала и требуется проведение очень большого объема работ.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>