Полная версия

Главная arrow География arrow БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Экспрессия интродуцированных генов

Доказав трансгенность полученных после трансформации регенерантов, необходимо показать экспрессию встроенных целевых генов, так как без стабильной экспрессии растение не может быть использовано ни в исследовательских, ни в хозяйственных целях. Для доказательства активности гена также используют ряд молекулярных методов.

Основные из них — дот-блот анализ (dot blot analysis — анализ методом гибридизации препаратов ДНК или РЕПС, нанесенных капельно на твердый носитель без предварительной рестрикции и электрофореза, с меченым ДНК-зондом) и Нозерн-блоттинг (Northern blot analysis — метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК, аналогичный методу Саузерн-блот- тинга). Из ткани растений выделяют тотальную РНК и молекулы РНК, разделенные электрофорезом, переносят с геля на нитроцеллюлозный или найлоновый мембранный фильтр. После гибридизации с комплементарными одноцепочечными мечеными молекулами ДНК (ДНК- зонды) или РНК выявляют сигналы в определенной области электро- фореграммы, что позволяет обнаружить гомологию РНК и ДНК-зонда. При использовании этих методов экспрессию трансгена можно увидеть по наличию и количеству специфических транскриптов.

Однако в ряде случаев экспрессию гена проще и надежнее контролировать по конечному белковому продукту (вестерн-блоттинг — Western blot analysis — метод выявления некоторых белков). После разделения с помощью электрофореза, белки соединяют с меченными радиоактивным веществом антителами и идентифицируют при рентгенологическом исследовании или по тому эффекту, который этот белок вызывает.

Уровень и стабильность экспрессии трансгенов в растении можно повысить при специальном конструировании концов вводимой ДНК.

Известно, что обязательным элементом генетической конструкции, без которого ген не экспрессируется, является промотор. И при создании трансгенных растений уровень экспрессии контролируемого промотором гена, кодирующего чужеродный белок, часто оказывается ниже, чем хотелось бы. Для решения проблемы поиска наиболее эффективного промотора, в растениях тестируют различные конструкции «промотор-ген», выбирая опытным путем наиболее активную.

Если исследователь ставит более сложные задачи в плане регулирования активности трансгенов, то в его распоряжении имеется в настоящее время достаточно широкий выбор промоторов и других регуляторных элементов, комбинирование которых позволяет достичь более тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях растения) и времени (в определенный период развития).

Генетическая активность введенного гена в клетках может зависеть от метилирования ДНК, которое играет важную роль в регуляции экспрессии генов в процессе развития. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, так же, как и встроенная, в процессе генетической трансформации экзогенная ДНК, нередко подвергаются метилированию. Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, возможно, и для полимераз. Получено много экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции активности генов. Напротив, гипометилирование про- моторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свидетельствует о функциональной активности генов.

Достаточно низкая активность встроенных генов наблюдается в случаях многокопийности. Генотипы с несколькими копиями трансгенов не обладают требуемыми признаками и выбраковываются в ходе селекционного процесса. Даже в случае встраивания одной копии трансгена его активность может быть недостаточной. Поэтому получают много трансформантов, из которых отбирают лучшие по активности трансгенов и по комплексу хозяйственных признаков, без видимых мутаций и других нарушений.

Часто уровень экспрессии зависит в значительной мере от того, в какую область ядерного хроматина попал введенный ген. Экспрессия трансгена, как правило, высока при его попадании в область активного хроматина. Кроме того, оказалось, что при встраивании в ядерный геном конструкция ДНК нередко претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т.д.), что приводит в основном к снижению экспрессии.

Было установлено также, что обычно применяемые процедуры трансформации вовсе не безразличны и для генома растения-хозяина. Во-первых, встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, нередко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации. Во-вторых, при агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокации фрагментов хромосом. Все это также может менять нормальное функционирование генома растения. Эти события случайны, и направленно увеличить экспрессируемость введенного гена нельзя. В таких случаях можно только отобрать растения-трансформанты, у которых наблюдается высокая экспрессия интегрированного гена.

Для кардинального повышения уровня экспрессии используют различные подходы. Во-первых, методом сайт-специфического мутагенеза изменяют те участки гена, которые могли бы быть ответственны за снижение эффективности транскрипции или трансляции в рас- тении-хозяине. Например, изменяют нуклеотидную последовательность трансгена, не изменяя аминокислотное строение белка. Это возможно сделать в связи с вырожденностью генетического кода, зная, что за одни и те же аминокислоты отвечают различные кодоны. Такие гены будут содержать кодоны, чаще используемые растениями по сравнению с теми, которые «предпочитают» грамположительные бактерии (в случае использования в качестве целевых генов бактериального происхождения) или по сравнению с теми, которые предпочтительнее для одних растений, чем для других. Можно внести также изменения, предотвращающие образование вторичной структуры у мРНК или исключающие появление сайтов полиаденилирования, характерных для растений, что может также снижать уровень экспрессии.

Еще одна важная проблема получения трансгенных растений — это проблема «замолкания» генов (gene silencing). Было обнаружено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцирован- ный ген через какое-то время теряет свою активность, перестаёт экспрессироваться, хотя физически сохраняется в геноме. То есть получается, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК. Было выяснено, что одним из основных факторов проявления «замолкания» генов является число идентичных копий гена, встроенных в геном. Чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность «замолкания» генов. Это связано с тем, что длинные последовательности (более 100—300 п.н. ДНК) сигнальных частей трансгена (промоторы, терминаторы и др.) могут иметь гомологии с участками хозяйского генома.

Явление ослабления активности гена при увеличении числа его копий весьма широко используется в генетической инженерии для улучшения качественных характеристик сортов или пород. Так, с помощью привнесения дополнительных копий отдельных генов растений получены томаты с длительным сроком хранения (у них снижена активность фермента, разрушающего в процессе естественного созревания пектин, или фермента ответственного за образования фитогормона — этилена), картофель с повышенным качеством крахмала (без амилозы), соя, рапс с улучшенным качеством масла, кофе без кофеина.

Другой фактор «замолкания генов» обнаружили, когда, задавшись целью получить сорт петуний с более яркими бордовыми лепестками, ввели в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента одного из антоцианов. Однако многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и получались белыми. Удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых «малых» РНК, которые являлись копией отдельных участков тех самых генов, которые вводились в клетку, и активность которых подавлялась. Эффект «гашения» экспрессии определенных генов малыми РНК получил название РНК — интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали siRNA (small interfering RiboNucleic Acids — малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты).

Молекулы siRNA, состоящие всего из 21—28 (у млекопитающих из 21—23) нуклеотидов, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двунитчатыми за счет спаривания друг с другом синтезируемых цепей с противоположных нитей по тем же законам комплементарности, которые формируют двунитчатые цепи ДНК в хромосомах. Кроме того, по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Затем с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex). Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся. Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза, может теперь связаться с комплементарным (строго соответствующим ей) участком однонитчатой мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие куски. Таким образом, и происходит блокирование тех генов, участок которых соответствует одной из цепочек внутри siRNA.

Для кардинального повышения уровня экспрессии встраиваемого гена используются также способы изменения частоты встречаемости кодонов в соответствии с частотой встречаемости кодонов в геноме вида растения, которое хотят трансформировать. Кодоны могут быть изменены 2 способами.

  • 1. Методом сайт-специфического мутагенеза (слабая модификация) изменяют те участки гена, которые могли бы быть ответственны за снижение эффективности транскрипции или трансляции в расте- нии-хозяине.
  • 2. Разрабывают и синтезируют химическими методами «полностью» измененную форму гена. Такой ген содержит кодоны, чаще используемые растениями по сравнению с теми, которые «предпочитают» грам- положительные бактерии. Вносят также изменения, предотвращающие образование вторичной структуры у мРНК или исключающие появление сайтов полиаденилирования, характерных для растений, что могло бы снизить уровень экспрессии.
 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>