Полная версия

Главная arrow География arrow БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

ОСНОВЫ ПРОВЕДЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РАБОТ

Водоросли, грибы, микроорганизмы, культуры клеток и тканей животных и растений, а также другие биологические объекты находят все более широкое применение в биотехнологии для решения многих вопросов, а также для получения ценных для народного хозяйства продуктов. Для этого требуются определенные методологические подходы, оборудование и условия, зависящие от поставленных задач.

Главными направлениями развития биотехнологии, которая является не только наукой, но и отраслью производства, будут следующие:

  • — молекулярная биология и генетическая инженерия;
  • — микробиология и микробиологическая промышленность;
  • — культура клеток и тканей in vitro.

Рассмотрим основные принципы, которые необходимо учитывать при проведении биотехнологических работ.

1. Помещения для проведения биотехнологических работ

Основой планирования помещения для работы с культурой клеток, тканей и органов является специализированный блок, состоящий из моечной комнаты, помещения для стерилизации сред, инструментов и материалов, комнаты для приготовления питательных сред, асептического и термостатированного помещений, лабораторных комнат, и комнат для культивирования.

Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях лучше покрыть кафелем, а потолок побелить.

Моечная комната должна быть свободной по площади, иметь моечные машины или мойки из кислотоустойчивого материала, поскольку при мытье посуды могут применяться крепкие кислоты и щелочи, холодную и горячую воду. Необходимо разместить в ней дистилляторы и бидистилляторы, а также бутыли для хранения этой воды. Для обработки посуды кислотами желательно иметь отдельный отсек, эмалированные кюветы и сосуды. В моечной комнате устанавливают стеллажи для сушки посуды, а также сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды — до 100—130°С, для инструментов — до 170°С. Необходимо также иметь емкости для хранения моющих средств и вытяжные шкафы, где размещаются эксикаторы для хромпика (98% H2S04 + К2Сг07), используемого в некоторых случаях для мытья посуды.

ш

Комната для приготовления питательных сред оборудуется лабораторными столами, шкафами для хранения чистой посуды и реактивов, холодильниками для хранения питательных сред. В случае отсутствия весовой комнаты в ней можно установить аналитические и торсионные весы для взвешивания минеральных солей, углеводов, агара и других компонентов питательных сред. Желательно иметь иономер для определения pH питательных сред, магнитные мешалки, плитки и набор различной посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.). Химические реактивы, используемые для приготовления питательных растворов, должны иметь надлежащую степень чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).

Помещение для стерилизации сред, инструментов и материалов оборудуется автоклавами (режим работы — давление 1—2 атмосферы и температура 120°С), сушильными шкафами для стерилизации сухим жаром, аппаратами для дистилляции и бидистилляции воды, столами для размещения стерилизуемых сред и материалов, шкафами для их хранения. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Стерильное помещение (бокс, операционная комната) для изоляции и пересадки культур наиболее важное в специализированном блоке. Его следует располагать дальше от источников заражения, нагревательных устройств и мест с усиленным движением. Асептическое помещение не должно иметь окон и газовой проводки и, по возможности, быть большим (около 15 м2). Можно предусмотреть создание нескольких операционных комнат для выполнения различных работ и закладки одновременно нескольких опытов.

В последнее время широкое распространение получают ламинарные боксы (камеры ламинарного потока стерильного воздуха), которые производятся в ряде стран, в том числе и России. В зависимости от объема выполняемых работ в помещении их устанавливают от одного до пяти.

В стерильном боксе не должно быть лишних предметов во избежание заражения изолируемых тканей. Желательно использовать рабочие столы, покрытые гладким, легко стерилизующимся материалом. Пол, потолок, стены и другие поверхности должны быть покрыты материалами, на которые мало садится пыль, и их можно легко мыть и дезинфицировать. В бокс должен поступать стерильный кондиционированный воздух. Для этой цели используют специальные очистительные фильтры. Стерильность воздуха достигается также с помощью бактерицидных ламп.

В термостатированном помещении (культуральная) с кондиционированным воздухом, строго регулируемой температурой (для большинства культур 25—27°С) и относительной влажностью воздуха (70%) на стеллажах и полках размещают изолированные культуры. В этой же комнате можно поместить различные установки для накопительного культивирования клеточных суспензий.

Отдельные помещения необходимы для крупномасштабных работ с клеточными суспензиями, выращиваемыми в различных режимах глубинного культивирования.

Культуральные комнаты могут иметь световое отделение, имеющее источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), а также искусственное освещение с регулируемой интенсивностью и спектральным составом света. Необходимо иметь и темновое отделение. Для культивирования эксплантов в некоторых случаях используют термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.

Банк клеточных культур — комната, где в условиях глубокого замораживания хранят ценные половые и соматические клеточные линии, меристемы, эмбриоиды. Для этой цели используют различные аппараты программного замораживания.

Недопустимо поступление в операционную и культуральную комнаты различных летучих веществ (фенол, формалин).

Должна быть комната для обработки и хранения данных экспериментальной работы.

2. Посуда, инструменты и материалы

Для биотехнологических работ необходимо иметь определенный набор посуды, разнообразие и количество которой зависят от поставленных задач и масштабов проводимых исследований. Это должна быть посуда для приготовления питательных сред, для хранения этих сред и бидистиллированной воды, посуда для пересадки и для выращивания, а также должны быть инструменты для изолирования и посадки тканей на среды.

Среди посуды для выращивания особое внимание надо уделить пробиркам для выращивания клеточных суспензий на роллере и культуральным сосудам для специальных целей (изучение питания корней отдельными компонентами, для накопительного и проточного культивирования клеточных суспензий). Эта посуда должна быть оснащена боковым тубусом для стерильного забора проб.

В последние годы все большее распространение приобретает использование автоматических пипеток с регулируемым объемом. Это позволяет значительно ускорить процесс приготовления питательных сред.

Для биотехнологических работ необходимо иметь вату и марлю. Вату используют для приготовления пробок, ватных тампонов для пипеток и стеклянных трубок, а также для стерилизации рабочих столов и лами- нар-боксов. Марлю — для оборачивания ватных пробок, фильтрации сред, изготовления косынок, мешочков, повязок. Изготовление ватных пробок вручную — процесс трудоемкий и длительный. Для этих целей лучше использовать аппарат для изготовления ватных пробок, который имеет устройство, регулирующее высоту и диаметр пробок. Это значительно облегчает и ускоряет процесс их изготовления.

пз

Для предохранения сред от высыхания колбы закрывают сверху целлофаном, алюминиевой фольгой или полиэтиленовой пленкой, закрепляя их резиновыми кольцами. Алюминиевую фольгу применяют также для изготовления колпачков на культуральные сосуды.

При стерилизации посуды в автоклаве ее помещают в плотную оберточную бумагу и обвязывают толстыми нитками или шпагатом. Оберточную бумагу используют также для изготовления листов, между которыми помещают стерильные инструменты для охлаждения. Нейлоновая ткань различной плотности, металлические сита с разным размером отверстий необходимы для фильтрования клеточных суспензий. Для предохранения от высыхания высеянные на агаризованные среды клеточные суспензии используют лейкопластырь или липкую ленту. Пробирки с культивируемыми тканями помещают в штативы разных типов и размеров.

Качество и мойка посуды. Посуда для работы с культурой ткани изготовляется из жаростойкого и кислотоустойчивого боросиликатного стекла типа (типа «Пирекс») и характеризуется высокой устойчивостью к повышенным температурам и механическим повреждениям. Вся посуда, предназначенная для приготовления, хранения питательных сред и выращивания растительного материала, подвергается тщательной мойке, особенно в тех случаях, когда ткань будет контактировать со стеклом (при выращивании суспензионных культур и культур корней).

Посуда моется в растворах детергентов (можно использовать и стиральный порошок), далее промывается 8—10 раз проточной водой и помещается на 4—6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия). После этого еще раз промыть посуду теплой водой (10 раз), затем дважды дистиллированной и бидистиллированной водой. Недостаточно отмытая от кислот и щелочей посуда может быть причиной плохого или неравномерного роста биологических объектов.

Обработку пробирок, чашек Петри, небольших культуральных сосудов можно проводить в эмалированных или полиэтиленовых кюветах, ведрах с кислотоустойчивыми ручками, а пипеток — в широких толстостенных стеклянных цилиндрах. Внутренние поверхности колб и бутылей больших размеров, в том числе и резервуаров для хранения дистиллированной и бидистиллированной воды, несколько раз смачивают хромпиком и через 20—30 мин промывают так же, как и остальную посуду. Пипетки необходимо мыть в приборе для мытья пипеток теплой проточной водой в течение часа.

Если после приготовления сред, пересадки и изъятия тканей посуда не может быть вымыта сразу, ее необходимо замочить в теплой воде во избежание засыхания на стенках частиц агара.

После мытья посуду высушивают в сушильном шкафу при 100— 130°С, закрывают ватными пробками или целлофановыми колпачками и хранят в контейнерах или шкафах, защищенных от попадания пыли. Если длительное время чистую посуду не используют, то перед употреблением ее следует ополоснуть бидистиллированной водой.

3. Соблюдение стерильности в биотехнологии

Для многих биологических объектов, особенно для клеток растений и животных, основным условием их успешного культивирования является стерильность питательной среды, посуды, материалов, инструментов, посадочного материала, помещения для изоляции и пересадки и т.д.

Стерилизация может быть достигнута следующими методами: влажным жаром (автоклавирование, дробная стерилизация — тиндализа- ция, кипячение, пастеризация); сухим жаром (нагревание с помощью горячего воздуха в специальных шкафах при температуре 120—180°С, обжигание); с помощью различных химических веществ, фильтрованием, центрифугированием, облучением ультрафиолетовыми лучами.

Стерилизации должна подвергаться и операционная комната (бокс), в которой производят посадку и изоляцию культур, одежда и руки работающего персонала, посуда, все необходимые инструменты и материалы, питательные среды, объекты культивирования.

Помещения для работы и их стерилизация. Предпосадочная стерилизация операционной комнаты или бокса является обязательным процессом, в результате которого должны быть устранены источники возможной инфекции тканевых и клеточных культур (бактерии, споры, грибы). Она состоит из двух этапов. В первую очередь помещение очищают от грязи и пыли. Грязь удаляют тщательным отмыванием водой с мылом рабочей поверхности столов, стен, пола, всевозможных углов. Вторым этапом обработки является стерилизация ультрафиолетовым облучением, которое губительно действует на вегетирующие формы микроорганизмов. В качестве источника облучения используют бактерицидные ультрафиолетовые лампы, излучателем в которых служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления.

Для стерилизации операционной комнаты площадью 9—12 м2 и высотой до 3 м можно применить ртутно-кварцевую лампу типа ПРК-7, мощностью 1000 Вт. Лампа должна размещаться так, чтобы равномерно облучать все части помещения. Вследствие вредного действия на организм человека ультрафиолетовых лучей и образующегося озона, стерилизацию облучением проводят накануне работы (вечером) на протяжении 1,5—2 ч. Для стерилизации помещений меньшего размера или боксов в верхней их части и над рабочей поверхностью укрепляют бактерицидные аргонно-ртутные лампы типа БУВ-15 или БУВ-30, которые включают за несколько часов до работы. Эти лампы имеют мощность 15 и 30 Вт.

Пыль в воздухе представляет большую опасность и может приводить к заражению культур. Кроме того, в пыльных помещениях снижается эффективность действия ультрафиолетовых лучей. Для удаления пыли и спор микроорганизмов помещение периодически обрабатывают водяным паром или применяют этиленгликоль. Выпаривание растворов пропилена или этиленгликоля можно проводить в фарфоровой чашке на электрической плите. Из зарубежных препаратов заслуживает внимания «Аэрогерм», производимый в Германии. В его состав входят: триэтиленгликоль — 20%, спирт — 12%, оксипропионовая кислота — 3% и дистиллированная вода — до 100 г смеси. Доза этого препарата — 0,3—0,5 г на 1 м3 объема помещения.

Для лучшего удержания частиц пыли рекомендуется покрывать поверхность столов вазелиновым маслом. Когда такая процедура нежелательна, ее можно заменить обработкой 70%-ным спиртом с 0,1% HgCl2. Для предохранения тканевых культур от грибковых инфекций периодически проводят дезинфекцию операционной комнаты смесью паров формальдегида и воды или распылением раствора формальдегида. В тамбуре перед операционной комнатой желательно положить коврик для ног, смоченный дезинфицирующим раствором (хлорамин). Для поддержания стерилизующего эффекта облучения необходима хорошая герметизация операционной комнаты, где необходимо строго соблюдать правила работы.

При тщательном проведении стерилизации посуды, аппаратов, питательных сред, посадочных тканей и бокса источником инфицирования культур может быть только работающий персонал. Заражение, происходящее в этом случае, может возникнуть от использования нестерильных инструментов во время работы, выдыхаемого воздуха, пыли, соприкосновения объекта посадки с нестерильными предметами или руками. Непосредственно перед работой обязательна дезинфекция рук, тщательное мытье их мылом и щеткой под струей теплой воды.

Ламинар-боксы и их стерилизация. Перед началом работы все поверхности ламинара обрабатываются 96% спиртом. Простерилизо- ванные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ-излучение. Через 20 минут выключают УФ-лампы и включают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатываю 96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в стакан с 96% спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают над пламенем спиртовки.

Стерилизация посуды и материалов. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена. Не рекомендуется помещать влажную посуду в горячий шкаф, так как это может быть причиной ее повреждения. Культуральные сосуды (колбы, пробирки, чашки Петри, флаконы и т.п.) перед заполнением их питательными средами предварительно стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу, размещая на решетчатых металлических подставках. Продолжительность стерилизации: при 150° С — 2,5 ч при 160° — 2 ч, при 170° — 1ч. Следует иметь в виду, что для минимального времени, необходимого для стерилизации, требуется вносить поправку на время, необходимое для нагрева загруженных в шкаф предметов до заданной температуры. Если стерилизации сухим жаром подвергается посуда, завернутая в бумагу или имеющая ватные тампоны, то температура шкафа не должна превышать 160°С, так как при 170°С бумага и вата желтеют и разрушаются.

П6

Поскольку влажный жар более эффективно убивает микроорганизмы и их споры, чем сухой, то стерилизацию посуды (стаканов с крышками или стеклянными пластинками, чашки Петри, пипетки, колбы с дистиллированной водой) и материалов (вата, марля, ватные пробки, бумага, халаты, шапочки), которые будут использоваться при посадке тканей, проводят под давлением, автоклавируя их при 2 атм (133°С) в течение 25—30 мин. Некоторые предметы требуют более длительной стерилизации.

Стерилизацию под давлением удобно проводить в горизонтальном электрическом автоклаве с регулировкой давления типа ГК-ЮО-2. Посуду (стаканы с крышками, чашки Петри) тщательно заворачивают в фольгу или в чистую оберточную бумагу (по одному стакану с крышкой, по одной или по несколько штук чашек Петри). Чашки Петри, кроме того, удобно стерилизовать в стерильных металлических тонкостенных контейнерах. Их перед стерилизацией следует помещать в открытом виде в сушильный шкаф на 2—3 ч для удаления различных летучих материалов.

Аппараты (части аппаратов для культивирования суспензии, фильтры и тому подобное) перед стерилизацией также заворачивают в бумагу и, если необходимо, перевязывают шпагатом. Выходные отверстия стеклянных трубок закрывают ватными тампонами.

При автоклавировании градуированных пипеток верхнюю их часть закрывают ватной прокладкой (приблизительно на 2 см) и каждую из них отдельно заворачивают в папиросную бумагу. Пастеровские пипетки, также заправленные ватными тампонами, удобно стерилизовать в стеклянном пенале, закрытом крышкой (для этого можно использовать толстостенные стеклянные цилиндры на 0,5—1,0 л, закрыв их пробкой из ваты). Для предупреждения поломки кончиков пипеток на дно пенала следует положить вату.

Вату, марлю, пробки, халаты, шапочки, марлевые мешочки автоклавируют в металлических биксах разных размеров, открыв боковые шторки. Листы бумаги, которые используют для закладки инструментов, помещают в чехол из такой же плотной оберточной бумаги. Стерилизуемые объекты не следует плотно загружать в автоклав для лучшего прохождения пара во все прослойки между ними и равномерного нагревания.

Перед стерилизацией необходимо обязательно проверить уровень воды в нагревательной камере автоклава. Если требуется проверить правильность показаний манометра, то в автоклав между стерилизуемыми предметами закладывают запаянные ампулы с веществами, имеющими постоянную точку плавления, к которым добавляют немного анилинового красителя (фуксин, метиленовая синька). К таким веществам относятся: бензонафтол (точка плавления 110°), антипирин (112°), резорцин чистый (118°), сера (119°), бензойная кислота (120°). После окончания автоклавирования сверяют плавление определенного соединения с показаниями манометра.

Стерилизация инструментов. Предварительную стерилизацию инструментов производят нагреванием их сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 140°С, либо кипячением в воде. При втором способе стерилизации режущие части инструментов заворачивают в марлю или вату, чтобы уберечь их от ударов, и опускают в кипящую воду, куда добавляют буру или 1%-ный бикарбонат натрия. Кипячением удобно стерилизовать шприцы, ножницы, пробочные сверла. Шприцы надо погружать в холодную воду. Не допускается стерилизовать металлические инструменты автоклавированием, так как под действием пара они ржавеют и тупятся.

Простерилизованные указанными способами инструменты переносят в бокс, где они еще дополнительно стерилизуются ультрафиолетовыми лучами при стерилизации комнаты.

В боксе непосредственно перед работой и в процессе посадки инструменты еще раз стерилизуют, помещая в фарфоровый стакан с 96°-ным этиловым спиртом и обжигая каждый из них в пламени спиртовки. Обжигать можно ланцеты, пинцеты, петли. После стерилизации обжиганием каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной оберточной бумаги, сложенными в пачку. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Перед повторным употреблением его следует снова про- стерилизовать спиртом и обжечь. Очень тонкие инструменты (иглы, фрагменты лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт или в стерильную воду.

Стерилизация растительного материала. Поверхностные покровы всех органов растений обычно загрязнены спорами различных микроорганизмов и грибов, поэтому перед стерилизацией их тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами и очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов — кору, с почек — кроющие чешуйки.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Na, сулемой) или бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно. Ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5—7% раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5—8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5—5% раствора для обработки любых эксплантов в течение 1—20 мин. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2—3% раствор в течение 10—15 мин, а для сухих семян 3—5% раствор в течение 1 ч. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н НС1, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1—6%. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1—3 мин, сухие семена — 30—60 мин, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2—3 раза.

Сулема — токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1% раствор в течение 1—3 мин, для корней и клубнеплодов — до 10—20 мин.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2% растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80 и хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10—80 мг/л, ампициллин 200—400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

Техника стерилизации. Один из заранее простерилизованных трех-четырех сосудов с крышками заполняют стерилизующим раствором, остальные стерильной водой. Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный материал помещают (если необходимо) на несколько секунд в этиловый спирт, а затем в стерилизующий раствор и отмечают время начала стерилизации. Не рекомендуется использовать для посадки клубне- и корнеплоды, которые плавают на поверхности раствора. Концы отрезков стеблей, черешков, листьев, цветочных и верхушечных почек парафинируют во избежание попадания в проводящие сосуды стерилизующего вещества, которое может вызвать повреждение ткани. Если эта процедура не выполняется, то перед вычленением ткани концы стебля или черешка удаляют скальпелем. Мелкие объекты (семена, плоды, почки) удобно стерилизовать и промывать в марлевых мешочках, затянутых сверху ниткой, которые пинцетом переносят из одного сосуда в другой. По истечении времени стерилизации растительный материал стерильным пинцетом переносят в сосуды со стерильной водой, выдерживая в каждом из них по 10—15 мин. Простерилизованные и промытые объекты, помещенные в стерильные чашки Петри или Коха, готовы для вычленения фрагментов тканей и посадки их на питательные среды.

4. Культивирование клеток растений in vitro

Как и в случае клеток животных, состав питательных сред для выращивания биологических объектов растительного происхождения чрезвычайно разнообразен. Их основой является смесь минеральных солей (макро- и микроэлементов). Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора — в виде фосфатов; серы — в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са+2, Mg+2. Железо используется в виде хелатов [Fe2S04 или Fe2S04 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль Na-ЭДТА (трилон Б)] — наиболее доступная форма для усвоения, в частности растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительновосстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са+2, Ch, Н+ необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20—60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и др.). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы — витамины группы В (Вх, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит. Тиамин (Bj) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы. Пиридоксин (В6) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и пере- аминирования аминокислот. Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДО, катализирующих донорноакцепторную цепь Н+ (отнятие Н от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития — фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей; инициируют гистогенез, деление и растяжение клеток: участвуют в процессах старения и созревания; стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур; обуславливают формирование пола.

Обязательными компонентами питательных сред являются ауксины, вызывающие дифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде (З-индолил-З-уксусной кислоты (гетероауксином) — ИУК. Наиболее выраженный его эффект проявляется в стимуляции роста. Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении кал- лусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней, луковиц, а также при заложении вегетативных почек.

Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют синтетические аналоги ИУК. Молекулы синтетических ауксинов имеют разную структуру, они содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты. Это — индолил-3-масляная кислота (ИМК); а-нафтил- 1-уксусная кислота (НУК); 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); фенилуксусная кислота (ФУК); фенилмасляная (ФМК).

Кислоту 2,4-Д применяют для индукции каллуса у злаков, бобовых, томатов; для роста суспензионных культур; в сочетании с другими фитогормонами для формирования у протопластов клеточной стенки. ИУК. ИМК, НУК, ФУК и ФМК применяют в качестве индукторов образования корней, а в сочетании с цитокининами эти фитогормоны могут быть использованы для развития проростков при культивировании изолированных зародышей.

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин 6-бензиламинопурин, зеатин, которые представляют собой N-замещенные производные аденина. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Цитокинины в состав сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при регенерации проростков из соматических эмбриоидов или стеблевых почек.

При культивировании протопластов в состав культурных сред добавляют абсцизовую кислоту.

Гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Важное свойство гиббереллинов — вызывать вытягивание стебля у розеточных растений или у растений с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и генетическую карликовость. Гиббереллины относят к условно половым гормонам; например, у тыквенных они способствуют образованию мужских цветков. Для гиббереллинов доказано их непосредственное действие на биосинтез ферментов, например, а-амилазы и других гидролаз в прорастающих семенах злаков; эти ферменты расщепляют крахмал до простых сахаров, которые усваиваются развивающимся зародышем.

Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту, которая производится промышленностью. Обработка семян и клубней приводит к снятию покоя и стимулирует быстрое их прорастание.

Действие гибберелловой кислоты на озимые злаки заменяет яровизацию, необходимую для таких растений. В составе культуральных сред используют гибберелловую кислоту для поддержания роста суспензионных культур, а также для индукции побегообразования.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10—15% от общего объема среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины — кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

При культивировании объектов применяют жидкие и агаризован- ные (твердые) среды.

Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара — полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6—6,0. Иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар- агара используют полиакриламидные гели (биогели) Р10 и Р200.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее. Это так называемые маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0--Ь4°С; витамины,

фитогормоны, ферменты, растительные экстракты — при -20°С в небольших по 5—10 мл в сосудах с пробками (пенициллиновые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10—40 раз, микросолей — в 100—1000 раз, витаминов — в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами. Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли — раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА либо Na ЭДТА — трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый витамин отдельно.

Фитогормоны — это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5—2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5—1 н НС1 или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

К настоящему времени разработано множество питательных сред, состав некоторых из них приведен ниже.

Питательная среда Чапека для культивирования фитопатогенных грибов

Компоненты питательной среды, г/л

NaN03

2,0

КН2Р04

1,0

MgS04 • 7Н20

0,5

КС1

0,5

FeS04 • 7Н20

0,01

Сахароза

30

Агар-агар

17

Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Среда Мурасиге-Скуга (МС)

Среда

Гамборга(В5)

Среда

Уайта

Na2S04

200

Ca(N03)2

200

NH4NO

1650

2500

KN03

1900

80

KC1

65

CaCl2 • 2H20

440

150

MgS04 ? 7H20

370

250

360

(NH4)2S04

130

KH2P04

170

16,5

Na2 ЭДТА

373

37,3

37,3

FeS04 • 7H20

27,95

27,95

27,95

NaH2P04 • H20

150

Окончание таблицы

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Среда Мурасиге-Скуга (МС)

Среда

Гамборга(В5)

Среда

Уайта

н3во3

6,2

3,0

1,5

MnS04 • 4Н20

22,3

10,0

4,5

ZnS04•7Н20

8,6

2,0

1,5

KI

0,83

0,75

0,75

Fe2(S04)3

2,5

Na2Mo04 • 2Н20

0,25

0,25

0,0025

CuS04 • 5Н20

0,025

0,025

0,02

СоС12 • 6Н20

0,025

0,025

Глицин

2,0

3,0

Мезоинозит

100

100

10

Никотиновая кислота

0,5

1,0

0,5

Пиридоксин — НС1

0,5

1,0

0,1

Тиамин — НС1

1,0

10,0

ОД

Сахароза

30 000

30 000

20 000

5. Факторы, влияющие на продуктивность культур in vitro

На рост и развитие биологических систем большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность. Рассмотрим эти вопросы на примере клеточных культур высших растений.

Свет. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, например каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, неспособные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, например у люцерны. Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют при освещенности 1000—4000 лк. Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету.

Освещенность климатической камеры или световой комнаты должна составлять в зависимости от культуры 3000—10 000 лк. Необходимо учитывать также фотопериод, который необходим для данного культивируемого объекта.

В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс.

Температура оказывает значительное влияние на рост культур в условиях in vitro. Для большинства культивируемых тканей температурный оптимум составляет 22—25°С. Для культур тканей тропических растений он может достигать 29—30°С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20°С.

Аэрация. Условия аэрации имеют важное значение для успешного выращивания клеток тканей и органов. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Осмотическое давление в клетке имеет большое значение в нативных условиях. При этом на соответствующих этапах роста и развития отдельные клетки, ткани характеризуются определенным градиентом осмотического давления. Это условие и требование сохраняется и при культивировании тканей и органов. Однако при этом надо учитывать, за счет каких веществ поддерживается осмотическое давление, так как оно в основном поддерживается за счет элементов питания и других соединений.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должны составлять 60—70%. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению концентрации, входящих в ее состав компонентов и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Газовая фаза в нативных условиях роста клетки ткани значительно отличается от газовой фазы в условиях in vitro. Известно, что от его состава (т.е. от соотношения — кислород, азот, углекислота) зависит как интенсивность клеточного деления (скорость роста), так и процессы дифференциации и формообразования в культурах in vitro. Однако оптимальные условия газового режима в культуре клеток и тканей еще требуют изучения и, к сожалению, не всегда известны.

Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер, где все эти параметры искусственно задаются.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>