Лабораторная работа № 8. Высев суспензионной культуры на твердую агаризованную среду

Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать микроколонии и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость этого материала. Одиночные клетки используются в клеточной селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время — это хорошая модель для изучения ее онтогенеза и физиологии. Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде. Для получения микроколоний каллусной ткани используется метод плейтинга — смешивание суспензии клеток с агаризованной питательной средой в равных пропорциях.

Цель работы: получить микроколонии каллусной ткани из суспензии клеток.

Оборудование и материалы: стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, 96% спирт.

Объект исследования: суспензионная культура.

Ход работы: клеточную суспензию перелить в стерильный цилиндр и оставить на 5 мин. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4% агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафилмом. Рассчитать количество высеянных клеток. Количество колоний подсчитать через 3—6 недель.

Задание: результаты зарисовать, подсчитать количество выросших колоний в каждой чашке Петри.

Определить эффективность высева, для этого:

где ЭВ — эффективность высева.