Количественная оценка метаболизма микроорганизмов

Последние достижения в аналитической методологии позволяют проводить измерение метаболической активности микроорганизмов в их природных экологических нишах, однако при постановке опытов следует учитывать возможные возмущения микроокружения клеток при введении измеряющих объектов. Так, простое ограничение микрониши стенками может вызвать пристеночный эффект, а отбор проб из ограниченного пространства — нарушить газовый баланс (содержание кислорода). Все это приводит к снижению точности и воспроизводимости результатов измерений.

Определение гетеротрофного потенциала данной экониши ведут при изучении включения радиоактивной метки (обычно |4С) из введенных в образец меченых гетеротрофных субстратов. Этот подход предполагает, что субстрат из среды потребляется, подчиняясь кинетике реакций первого порядка и что скорость поглощения увеличивается с увеличением концентрации субстрата до достижения максимальной (Ктах). Это значение можно подсчитать, пользуясь уравнением Михаэлиса—Ментен и строя график зависимости скорости поглощения субстрата от его концентрации в координатах Лайнуивера—Берка.

Определение скоростей активности микроорганизмов этим методом ограничено набором субстратов, используемых данным сообществом. Обычно при определении гетеротрофного потенциала местообитания используют ацетат, глюкозу и другие углеводы, глутамат и другие аминокислоты или смесь меченых продуктов фотосинтеза, образуемых после инкубации водорослей на свету с 14С02.

При оценке метаболической активности популяций определяют также процент дыхания, подсчитываемый как отношение суммы включенного 14С и выделившегося ,4С02 к выделившемуся ИС02, выраженному в процентах. Проценты дыхания — показатель количества энергии, затрачиваемой популяцией на поддержание устойчивости системы, причем чем выше процент дыхания, тем больше метаболической энергии тратится на поддержание.

Измерение скорости микробной продукции проводят обычно с использованием меченного тритием тимидина {[3Н]-Тд>, который включается непосредственно в ДНК при биосинтезе и отражает скорость роста микроорганизмов в популяции или прироста биомассы. Поскольку [3Н]-Тд включается лишь в бактериальную ДНК, этот метод оказался чрезвычайно удобным для анализа скоростей роста водных бактериальных популяций. Измерение этого же процесса в почве связано с несколькими экспериментальными трудностями. [3Н|-Тд сорбируется гуминовыми веществами, находящимися в почве в больших количествах, а также на минеральных веществах глинистых веществ и некоторых оксидов, а почвенную ДНК трудно экстрагировать.

Скорость фотосинтеза измеряют обычно в водных образцах в светлых и темных склянках с введенной порцией 14С02. Образцы инкубируют в течение нескольких часов или всего светового периода in situ и определяют скорость включения меченой углекислоты (обычно в течение первых 1 — 2 ч инкубации), что отражает скорость фотосинтеза и общее включенное количество |4С02 (за более длительный период), что соответствует чистой продукции фотосинтеза (т.е. разнице между количеством включенного ,4С02 и количеством органического вещества, минерализованного до 14С02 в результате дыхания).

Скорость дыхания определяют по измерению скорости выделения ,4С02 из органических субстратов, что отражает скорость минерализации органического вещества данной экологической ниши.

Существуют также методы нерадиоактивного определения метаболической активности, при которых измеряют скорость дыхания пробы, взятой из данного места, с помощью закрытого кислородного электрода Кларка, или способы измерения образования С02 в постоянно аэрируемой пробе, куда внесен субстрат дыхания. Для длительных экспериментов по улавливанию образующейся С02 разработаны специальные герметичные колбы с двумя сообщающимися отсеками, в одном из которых происходит химическое потребление образуемой С02 концентрированным раствором щелочи, а в другой помещают исследуемый образец.

Определение активности специфических ферментов также отражает метаболический потенциал микробной популяции данной экологической ниши. Активность одних ферментов (суммарных дегидрогеназ, эстераз, фосфатаз) отражает энзиматический потенциал всего сообщества, активность других (целлюлазная, хи- тиназная, нитрогеназная, денитрифицирующая) — только специфической части сообщества, позволяя, однако, оценить тот или иной его потенциал.

Ферменты микроорганизмов, включенных в биогеохимический цикл элементов, важны для экологов-микробиологов. Из них ферменты, вовлеченные в цикл углерода и азота, заслуживают особого внимания, так как позволяют оценить устойчивость сообществ и экосистем и их потенциал в отношении минерализации органического вещества. При измерении ферментативного потенциала популяций наряду с перечисленными показателями измеряют активности липаз, целлюлаз, протеаз, амилаз. При измерении ферментативных активностей in situ важно не нарушать микроокружение данной ниши и следить за температурой, pH, влажностью, Eh (ОВП), а периоды инкубации (измерений) должны быть достаточно короткими, чтобы за это время число микрорга- низмов не могло значительно измениться.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >