Полная версия

Главная arrow Медицина arrow БИОХИМИЯ Часть 2.

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

31.3.2. Трансформация микробных клеток

На основе генно-инженерных методов можно конструировать микробные клетки, способные синтезировать структуры растительного и животного происхождения, имеющие важное значение для медицины и промышленности.

Инсулин играет основную роль в лечении диабета — болезни, по распространенности занимающей третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Получение этого гормона генно-инженерным способом представлялось весьма перспективным и было выполнено в начале 80-х гг. XX столетия. В качестве компетентной клетки использовали Е. coli, гены обеих цепей молекулы человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к З'-концу гена, кодирующего белок р-галакто- зидазу, и вводили в векторную плазмиду. Трансформированные клетки Е. coli

синтезировали химерные белки, состоящие из А- или В-цепи инсулина, присоединенной через метионин к р-галактозилазс. При помощи бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Далее цепи соединяли в единую активную молекулу инсулина. Образование дисульфидных цепей in vitro явилось лимитирующей стадией всего процесса, причем выход был незначительным. В связи с этим был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in vitro. Были синтезированы несколько десятков олигонуклеотидов, соединенных затем при помощи ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин, были встроены в плазмиду, а затем перенесены в Е. со//(рис. 31.5).

Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин. В настоящее время генно-инженерный инсулин широко применяется в медицинской практике.

Соматотропин — гормон роста — играет существенную роль в постнатальном развитии организма, контролируя многие стороны углеводного, липидного и минерального обменов. Дефицит гормона приводит к карликовости, лечение которой проводится посредством соматотропинотерапии. В отличие от инсулина соматотропин обладает видовой специфичностью, и до недавнего времени его выделяли из гипофиза трупов. Выраженная гетерогенность этого гормона негативно сказывалась на его фармакологическом эффекте. Получение генно-инженерного соматотропина явилось решением проблемы обеспечения медицины этим препаратом.

Получение инсулина человека генно-инженерным метолом (по В. А. Ефимову)

Рис. 31.5. Получение инсулина человека генно-инженерным метолом (по В. А. Ефимову)

Процедура получения генно-инженерного гормона проводилась с учетом того, что просоматотропин нс подвергается процессингу в бактериальной клетке. Был использован комбинированный метод получения гена соматотро- пина. Фрагмент ДНК, кодирующий первые 23 аминокислотных остатка с N-конца, был получен методом химико-ферментативного синтеза, а олигонуклеотид, кодирующий остальные аминокислотные остатки гормона, представлял собой кДНК, полученную посредством обратной транскриптазы на матрице мРНК. Затем оба фрагмента объединяли в одной плазмиде и переносили в Е. coli. Образованный гормон обладал биологической активностью, сопоставимой с гипофизарным соматотропином.

Интерфероиы - низкомолекулярные белки, обладающие выраженной противовирусной активностью. Кроме того, интерфероны проявляют фармакологический эффект при таких заболеваниях, как гепатит В, рассеянный склероз, некоторые локализации опухолей. Различают три класса интерферо- нов по месту их синтеза в клетках человека и животных: а-интерферон из лейкоцитов, p-интерфсрон из фибробластов и у-интерферон из тимуса, а-Интерферон является простым белком, р- и у-белки — гликозилированы. Интерферон является одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но он видоспецифичен и может быть получен только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна прежде всего из-за крайне малого выхода конечного продукта. Поэтому получение генно- инженерного продукта является перспективной альтернативой традиционным методам выделения интерферона.

Впервые ген интерферона был введен в бактериальную клетку Е. eoli около 20 лет назад, и в последующие годы техника генно-инженерных процедур постоянно совершенствовалась. Лейкоцитарный интерферон был получен на основе трансформированных клеток Е. coli следующим образом. Ген интерферона получали химико-ферментативным методом. Одной из трудностей, которую пришлось преодолеть, было то, что интерферон синтезируется в виде предшественника с дополнительной (сигнальной) последовательностью аминокислотных остатков. Бактериальные клетки нс имеют протеиназ, превращающих предшественники в зрелые белки, поэтому надо было синтезировать ген, кодирующий только зрелый интерферон. Такой ген в конце концов был получен и введен в клетку ?. coli. Рекомбинантный штамм синтезировал в больших количествах интерферон, обладающий выраженной биологической активностью. Значительным событием явилась удачная попытка введения гена интерферона в дрожжевые клетки. Ген, кодирующий интерферон, был получен с помощью мРНК и обратной транскриптазы. кДНК а-интерферона соединили с олигонуклеотидом, кодирующим алкогольдегидрогеназу дрожжей и встроили в плазмиду. Плазмиду, нагруженную чужеродными генами, ввели в дрожжевую клетку Saccharomyces cerevisiae. Замена промотора гена человеческого интерферона на ген дрожжевой алкогольдегидрогеназы обеспечила эффективную экспрессию гена интерферона. Замена бактериальной клетки в качестве реципиента на дрожжевую сыграла огромную роль для всей генно- инженерной техники вообще и для получения интерферонов в частности. Дело в том, что р- и у-интерфероны представляют собой гликозилированные белки, а процесс гликозилирования невозможен в Е. coli, но вполне осуществим в дрожжевой клетке.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>