Изолированные протопласты

Изолированный протопласт — это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой (рис. 3.10). Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует.

Изолированные протопласты высших растений в условиях in vitro

Рис. 3.10. Изолированные протопласты высших растений в условиях in vitro

Использование изолированных протопластов при изучении различных физиологических процессов (по Р.Г. Бутенко, 1999)

Рис. 3.11. Использование изолированных протопластов при изучении различных физиологических процессов (по Р.Г. Бутенко, 1999)

Протопласт в целой клетке можно наблюдать во время плазмолиза.

Изолированные протопласты относятся к одним из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазма- лемму (рис. 3.11). Главное преимущество изолированных протопластов состоит в том, что в них достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных. Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен в 1880 г. Д. Ханстейном.

Э. Коккинг установил, что изолированный протопласт, благодаря механизму пиноци- тоза, способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные молекулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изучения взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гибридные клетки. Таким способом можно добиваться получения гибридов от растений с разной степенью таксономической удаленности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза (Stratiotes aloides) во время механического повреждения ткани. Поэтому данный метод назван механическим. Это длительный и трудоемкий метод, позволяющий выделять лишь небольшое количество протопластов (выделение возможно не из всех видов тканей).

Современный метод выделения протопластов, получивший название ферментативного, заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования для ее разрушения ферментов: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы.

Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений ферментативным методом было осуществлено Э. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим, этот метод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое число протопластов, причем они не испытывают сильного осмотического шока. После воздействия ферментов смесь протопластов пропускают через фильтр и центрифугируют для удаления неразрушенных клеток и их осколков.

Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные условия для изоляции протопластов индивидуальны применительно к разным объектам, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизнеспособные протопласты, является подбор осмотического стабилизатора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС12, MgHP04, КС1). Концентрация осмотиков должна быть несколько гипертоничной, чтобы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же питательные среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения, их с большим успехом применяют при исследованиях генетической модификации протопластов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >