Клональное микроразмножение растений и его практическое применение

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения: получения в условиях in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т. е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

По сравнению с традиционными способами размножения, метод клонального микроразмножения, несомненно, имеет ряд преимуществ. Так, он обеспечивает:

  • — получение генетически однородного посадочного материала;
  • — получение безвирусных растений;
  • — высокий коэффициент размножения (105-106 — для травянистых и цветочных растений, 104-105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);
  • — сокращение продолжительности селекционного процесса;
  • — ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
  • — размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
  • — возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
  • — автоматизацию процесса выращивания.

Начало успешному применению метода клонального микроразмножения было положено в конце 1950-х гг. французским ученым Ж. Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Достижению успеха способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro.

В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 1960-х гг. в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под руководством профессора Р.Г. Бутенко. Были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии.

Области применения клонального микроразмножения разнообразны, и имеются тенденции к их постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использованию техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа (рис. 3.16): 1) выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2) собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов;

Схема клонального микроразмножения растений методом активации развития существующих меристем (I путь) и индукция образования адвентивных почек на первичном экспланте (II путь)

Рис. 3.16. Схема клонального микроразмножения растений методом активации развития существующих меристем (I путь) и индукция образования адвентивных почек на первичном экспланте (II путь)

  • 1 — выбор исходного экспланта; 2 — получение стерильной культуры; 3 — образование адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте; 4 — рост почек и формирование микропобегов; 5 — размножение микропобегов (микрочеренкование); 6 — укоренение микропобегов; 7 — депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2 °С); 8 — перевод растений в тепличные условия; 9 — высадка растений-регенерантов в поле
  • 3) укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2 °С, +10 °С);
  • 4) выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Микроразмножение растений можно осуществлять следующими методами:

  • — активацией развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки и ин- теркалярные зоны стебля);
  • — индукцией возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;
  • — индукцией соматического эмбриогенеза;
  • — дифференциацией адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях.

Из перечисленных методов клонального микроразмножения растений основным является метод активации развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования (рис. 3.17). Это может быть достигнуто двумя путями:

  • — удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормо- нальной среде;
  • — добавлением в питательную среду веществ цитокини- нового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бен- зиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2ip) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

В настоящее время этот метод широко применяют в производстве безвирусного посадочного материала различных растений (рис. 3.18, см. цв. вклейку). Это сельскохозяйственные культуры — технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис), овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.); культуры промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера); тропические и субтропические растения (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.); плодовые и ягодные культуры (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.); древесные растения (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур (таких, как картофель) технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития уже существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.

Второй из перечисленных методов — индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта — основан на способности изолированных частей

Схема размножения растений методом активации развития существующих меристем

Рис. 3.17. Схема размножения растений методом активации развития существующих меристем: 1 — удаление верхушечной меристемы;

2 — добавление в питательную среду цитокининов (Б/Г — безгормо- нальная среда; Ц — цитокинины; А — ауксины) растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения (рис. 3.19, см. цв. вклейку). Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в его сочетании с ауксином (в соотношении 10 : 1 или 100 : 1). В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют (З-индолил-З-уксусную кислоту (ИУК) или а-нафтилуксусную кислоту (НУК).

Индукция возникновения адвентивных почек — наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений: многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) были размножены из луковичных чешуек, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Brassica (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) — из сегментов гипокотиля, семядолей, листьев; лук, чеснок — из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты — из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный — из сегментов листовых пластинок; петуния —

Микроразмножение сосны из изолированных зародышей в условиях in vitro

Рис. 3.20. Микроразмножение сосны из изолированных зародышей в условиях in vitro

из сегментов корней; глоксиния, фиалки — из сегментов листовых пластинок; некоторые представители древесных растений — из изолированных зрелых и незрелых зародышей (рис. 3.20).

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биополярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. В настоящее время этот метод используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда, а также некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в две стадии. На первой стадии клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов (как правило, 2,4-Д) и превращаются в эмбриональные. На второй стадии клетки должны развиться в эмбриоиды, что достигается уменьшением концентрации ауксина или полным его исключением из состава питательной среды. Соматический эмбриогенез можно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ считается менее пригодным при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемким, так как не всегда удается реализовывать свойственную клеткам тотипотентность.

Однако данный метод размножения имеет свои преимущества, поскольку не требуется подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, так как соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани — мало используется для получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Наряду с генетическими изменениями растений наблюдаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму.

Несмотря на некоторые недостатки, метод дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани имеет положительные стороны:

  • — во-первых, он эффективен и экономически выгоден, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению;
  • — во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным методом размножения растений в культуре тканей;
  • — в-третьих, он представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные методом дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани, различаются генетически и морфофизиологически. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их интродукцию в полевых условиях.

Метод дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены сахарная свекла, некоторые представители рода Bras- sica, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен; разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов.

Основное преимущество клонального микроразмножения заключается в возможности получения генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Этого достигают, используя меристематические ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордиев) и является свободной от инфекции.

Предположение о возможности отсутствия вирусов в ме- ристематических тканях больных растений впервые высказано Ф. Уайтом (1943). Начиная с 1950-х гг. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Ж. Морель и С. Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстро растущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, нашли свое подтверждение в последнее время.

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений; дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения.

Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, существенно различается для разных видов и сортов растений, а также зависит от вида вирусов. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, но допускает возможность его медленного распространения через плазмодезмы, соединяющие мерис- тематические клетки.

При культивировании апикальной меристемы картофеля величиной 200 мкм на питательной среде и дальнейшем получении из нее растений-регенерантов было показано, что среди полученных растений только 10 % были свободны от Х-вируса, но 70 % — от Y-вируса.

Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений, что, впрочем, подтверждает общеизвестный факт: число лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало и многие меристемы пораженных растений инфекционны.

Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений оказывается низкой. Это было доказано результатами, полученными рядом меристемных лабораторий Российской Федерации и Крыма, а именно: из апикальных меристем растений гвоздики, цимбидиума, пораженных вирусами CarMV и CarVMV, в условиях in vitro получают инфицированные мериклоны.

В принципе возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Этого можно достичь путем применения методов предварительной термо- или хемотерапии исходных растений.

Метод термотерапии — использование сухого горячего воздуха — применяют как в условиях in vivo, так и в условиях in vitro. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы.

Согласно одной из них, высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы через их рибонуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы вирулентности.

Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температура воздействует на вирусы через метаболизм растений. Под влиянием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет, и наоборот.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры (термостат), где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру — 37 °С; освещенность лампами дневного света — 5 тыс. лк; фотопериод, в зависимости от культуры, — 14- 16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %.

Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10-12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 и более недель. Однако существуют растения (например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и др.), рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vivo. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.

Помимо положительного воздействия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличить коэффициент размножения на 50-60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.

Применение термотерапии в сочетании с меристемной культурой позволяет оздоровить от вирусного хлороза более 70 % растений-регенерантов хмеля, 90 % — земляники,

25 % — черной и красной смородины, 50 % — малины, более 80 % — картофеля.

Проверку растений на наличие вирусов, как правило, проводят с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов.

Второй метод освобождения растений от вирусов — хемотерапия — заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина — 1Р-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З- карбоскимида (коммерческое название — вирозол) в концентрации 20-50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений увеличивался до 80-100 %. Положительные результаты хемотерапии были получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.

Термо- и хемотерапевтические методы оздоровления посадочного материала от вирусов экономически малоэффективны. Поэтому в настоящее время с помощью методов трансгеноза создают формы растений с генетической устойчивостью к вирусам.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >