Конструирование фрагментов рекомбинантных ДНК («сшивка»)

Фрагменты рекомбинантных ДНК, полученные после действия рестриктаз и содержащие определенные гены, «сшивают» одним из трех основных методов, в зависимости от того, какие концы имеют фрагменты «сшиваемых» ДНК — «тупые» или «липкие».

«Сшивка» по одноименным «липким» концам. Это наиболее простой и популярный метод (рис. 4.6). Впервые этим методом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 г. Любые два фрагмента ДНК (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, дающей фрагменты рестрикции с «липкими» концами, могут «слипаться» за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов. Однако после такого спаривания полная целостность двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, т. е. «сшивания», или лигирования, нитей, используют ДНК-лигазу бактериофага Т4. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию: «сшивание» фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

«Сшивка» по «тупым» концам. «Тупые» концы можно соединять за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффектив-

ДНК 1

Схема метода получения гибридных молекул ДНК за счет ?сшивки* фрагментов по одноименным «липким* концам

Рис. 4.6. Схема метода получения гибридных молекул ДНК за счет ?сшивки* фрагментов по одноименным «липким* концам (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003) ность ниже, чем при «сшивке» по «липким» концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 г. П. Бергом в Стэнфордском университете (США). В частности, этот метод используют при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах.

«Сшивка» фрагментов с разноименными концами. В ситуации, когда необходимо «сшить» фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции и имеющие разные, т. е. некомплементарные друг другу, «липкие» концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры — это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Г. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Существуют большие наборы таких генных «переходников». «Липкие» концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с «тупыми» концами. При этом первоначально «достраивают» недостающие фрагменты, чтобы образовались комплементарные «липкие» концы. Далее для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимно-комплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью (рис. 4.7).

Схема метода получения гибридных молекул ДНК за счет «сшивки» фрагментов по разноименным концам (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003)

Рис. 4.7. Схема метода получения гибридных молекул ДНК за счет «сшивки» фрагментов по разноименным концам (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003)

Гибридизация — метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов

Реакция гибридизации используется в генетической инженерии для анализа гибридных молекул ДНК как весьма чувствительный метод выявления определенных последовательностей в ДНК и РНК.

Гибридизация основана на способности азотистых оснований образовывать комплементарные пары. Если солевой раствор ДНК нагреть до 100 °С и повысить pH до 13, то ДНК диссоциирует на две отдельные цепи (денатурирует, плавится), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. Этот процесс (его называют ренатура- цией или гибридизацией, отжигом) обратим: выдерживание ДНК при температуре 65 °С приводит к восстановлению структуры двойной спирали. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК — ДНК, РНК — РНК, РНК — ДНК.

Для теста необходимо иметь одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зон- дом. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >