Методы клонирования ДНК

Методами клонирования фрагменты ДНК любого вида, полученные с помощью рестриктаз, можно ввести в плазмиду или в бактериофаг, получив таким образом вектор, а затем размножить эти генетические элементы в клетках бактерий или дрожжей, увеличивая их число в миллионы раз.

Методы клонирования ДНК основаны на двух подходах:

  • — использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК (клонирование ДНК in vivo), а также создание банка генов (геномной библиотеки);
  • — амплификация ДНК in vitro.

Для биотехнологических экспериментов часто необходимо идентифицировать гены, кодирующие определенные структурные белки. Искомые последовательности можно обнаружить и идентифицировать благодаря геномным библиотекам, используя три широко распространенных метода: гибридизацию с меченым ДНК-зондом (ДНК-гибридиза- ция) с последующим радиоавтографическим анализом, иммунологический скрининг, скрининг по активности белка, кодируемого искомым геном.

ДНК-гибридизация состоит в комплементарном спаривании ДНК-мишени и меченого ДНК-зонда. Гибридные молекулы наиболее часто определяют радиоавтографическим методом.

Два других метода предполагают обнаружение ДНК-мишени благодаря продукту ее экспрессии — белку или его части. Присутствие белка обнаруживают иммунологическими методами (иммунологический скрининг) либо по активности белкового продукта, если таковая имеется (скрининг по активности белка).

Получение нужного гена, намеченного для переноса, возможно либо путем выделения его из подходящего генома, либо методами синтеза химическим или ферментативным путем, либо с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Часто нужный ген выделяют из банка генов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >