Амплификация ДНК in vitro

Амплификация — это увеличение числа копий молекул ДНК. В отличие от клонирования ДНК in vivo, которое происходит в клетках прокариот, дрожжей, других эукариотических организмов, амплификация осуществляется вне клетки (in vitro) с помощью химических методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции, NASBA- метода (Nucleic Acid Sequence — Base Amplification).

В 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 4.8). Амплификация фрагментов ДНК осуществляется благодаря работе особого фермента Taq-полимеразы (термостабильная ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus) в присутствии четырех типов нуклеоти-

Схема полимеразной цепной реакции

Рис. 4.8. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР) (по А.С. Коничеву и Г.А. Севастьяновой, 2003) дов и праймеров (коротких цепочек ДНК размером около 20 нуклеотидов, которые выступают в качестве затравок). Процесс циклический, проходит в несколько этапов: термическая денатурация (разделение комплементарных цепей ДНК при температуре 93-95 °С), охлаждение до 60 °С, связывание праймеров с одноцепочечными ДНК, синтез второй нити ДНК с помощью Taq-полимеразы. Повторяя циклы амплификации, можно получать миллионы копий фрагментов ДНК. Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3-4 ч, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе векторных молекул.

Для лигазной цепной реакции используют другой фермент — термостабильную ДНК-лигазу.

Наиболее универсальным методом амплификации служит NASBA-метод. В отличие от ПЦР, он осуществляется при температуре 41 °С, т. е. является изотермальным. Кроме того, в этом методе используют другие ферменты: РНК-полимеразу фага Т7, РНКазу Н и обратную транскриптазу вируса птичьего миелобластоза. Метод крайне чувствительный, его можно использовать для контроля пищевых продуктов, в медицинской диагностике, в судебно-медицинской практике.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >