Унифицированный гемоглобинцианидный метод.

В настоящее время в клинико-диагностической практике широко применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, характеризующиеся точностью и технической простотой. В большинстве стран эти методы приняты как стандартные и рекомендованы комитетом по стандартизации Европейского и Международного общества по гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964; Boroviczeny К. G., 1964).

В России основным методом количественного определения гемоглобина в клинической практике является унифицированный гемоглобинцианидный метод. Преимущества этого метода заключаются в использовании надежных и стабильных циангемоглобиновых стандартов, устойчивого трансформирующего раствора, что позволяет измерять все клинически значимые фракции гемоглобина. Точность гемоглобинцианидного метода определяется тем, что в его основе лежит превращение всех форм гемоглобина в низкоспиновую окисленную форму — циангемоглобин.

Гемоглобинцианидный метод, разработанный в 1936 г. Драб- киным, был одобрен Международным комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г.

Принцип гемоглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну — гемоглобинцианид. Одним из преимуществ метода кроме простоты и точности является тот факт, что HbCN — стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN.

Суть метода: кровь смешивают с реактивом Драбкина: KCN — 0,05 г, K3[Fe(CN)6] — 0,2 г, дистиллированной воды — до 1 л. Под влиянием железосинеродистого калия (красной кровяной соли) гемоглобин окисляется в метгемоглобин, который под действием ацетонциангидрина затем превращается в циангемоглобин (гемоглобинцианид). Циангемоглобин имеет красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Окрашенный цианметгемоглобин определяют колориметрически. Через 20 мин, необходимых для полного превращения гемоглобина в циангемоглобин, измеряют экстинкцию при длине волны 540 нм и толщине слоя 1 см против дистиллированной воды на спектрофотометре СФ-4 или на ФЭК-М или подобных ему фотоэлектроколориметрах.

Преимущества этого метода заключаются в использовании надежных и стабильных циангемоглобиновых стандартов, устойчивого трансформирующего раствора, что позволяет измерять все клинически значимые фракции гемоглобина.

Существуют и селективные методы колориметрии отдельных типов гемоглобина (методы Зингера, Ветке), но селективность их относительна: эти методы регистрируют щелочеустойчивую фракцию гемоглобина, к которой можно отнести как фетальный, так и примитивный (эмбриональный) типы гемоглобина. Метод Ветке, по сравнению с методом Зингера, обладает гораздо большей разрешающей способностью и отличается простотой.

Определение фетального гемоглобина по Зингеру в модификации Ветке.

Метод основан на резистентности фетального гемоглобина (и некоторых других типов гемоглобина) к денатурирующему действию щелочей. HbF в 155 раз более устойчив к 1/12 раствору натриевой щелочи, чем нормальный гемоглобин. Вначале гемоглобин превращают в циангемоглобин, что не мешает определению. Из гемолизата получают циангемоглобиновый раствор путем прибавления K3[Fe(CN)6] — KCN раствора (0,2 г K3[Fe(CN)6] + 0,2 г KCN до 1000 мл дистиллированной воды). Через 30 мин 2,8 мл этого циангемоглобинового раствора смешивают с 0,2 мл 1,2 М раствора NaOH. Через 2 мин прибавляют 2 мл насыщенного раствора (NH4)2S04.

Коагулированный денатурированный НЬА осаждают центрифугированием. HbF и другие щелочеустойчивые формы гемоглобина остаются в растворе. Концентрацию оставшегося в супернатанте гемоглобина определяют на спектрофотометре, отсчитывая экстинкцию фильтрата (ЕА) против воды при длине волны 540 нм.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >