Генетика митохондрий

Митохондрии - это, подобно хлоропластам, самовоснроизводящиеся полуавтономные органеллы клетки, содержащие кольцевые молекулы ДНК с различной контурной длиной. Они обеспечивают дыхание клеток растений, животных и эукариотических микроорганизмов. ДНК митохондрий по нуклеотидному составу и вследствие этого по плотности отличается от ДНК ядра (табл. 8.3). Митохондрии имеют собственный аппарат белкового синтеза, отличающийся от цитоплазматического и близкий к аппарату белкового синтеза прокариот.

Таблица 8.3

ДНК митохондрий микроорганизмов, растительных и животных клеток

Организм

Плотность ДНК, г/см!

ядро

митохондрия

Дрожжи - Sacch. cerevisiae

1,698

1,684

Простейшие:

Tetrahymena

1,685-1,692

1,684-1,686

Leishmania henrietti

1,721

1,699

Tripanosoma cruzi

1,710

1,699

Слизевик Physarum polycephalum

1,700

1,686

Животные:

Лягушка - Rana pipiens

1,702

1,702

Карп - Cyprinus carpo

1,697

1,703

Куриный эмбрион

1,701

1,707

Голубь - Calumba livia

1,700

1,707

Утка - Anas domestica

1,700

1,711

Морская свинка - Cavia porcellus

1,700

1,702

Печень мыши

1,701

1,701

Печень быка

1,703

1,703

Человек (лейкемические лейкоциты)

1,695

1,705

Водоросли:

Chlorella

1,717

1,712

Euglena

1,707

1,690

Высшие растения:

Pena - Brassica rapa

1,692

1,706

Лук- Allium сера

1,698

1,706

Многоклеточные эукариоты неудобны для изучения генетики митохондрий, поскольку их клетки - облигатные аэробы, которые не могут существовать при нарушении основной функции митохондрий - дыхания. В то же время дрожжи-сахаромицеты являются факультативными аэробами. При подавлении дыхания они могут существовать за счет брожения, используя для этого глюкозу и некоторые другие сахара в качестве источников углерода На неферментируемых источниках углерода например на этаноле, глицерине, лактате кальция, в отсутствие дыхания дрожжи не растут.

Первые сведения о признаках, контролируемых митохондриями, были получены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в конце 1940-х гг. в лаборатории Б. Эфрусси. У этих грибов известны мутантные формы, образующие на глюкозе мелкие колонии, так называемые Pe/i'ie-мутанты, фенотип которых обозначают РеГ в отличие от дикого типа РеГ. Мутанты РеГ не растут на неферментируемых источниках углерода, поскольку не способны к дыханию. Скрещивая гаплоидные клетки РеГ х РеГ, можно получить гибриды дикого типа, способные к дыханию. Тетрадный анализ таких гибридов (рис. 8.5) показывает, что признак РеГ от независимо полученных мутантов наследуется по-разному. Одни гибриды показывают нормальное расщепление (2РеГ : 2РеГ), а другие не обнаруживают расщепления в тетрадах (4РеГ : 0РеГ). Очевидно, в первом случае неспособность к дыханию определяется хромосомной мутацией, а во втором - нехромосом- ной, по-видимому, цитоплазматической. Эти два типа мутантов РеГ были названы соответственно генеративными и вегетативными.

Нехромосомную природу вегетативных ЛгГ-мутаитов подтвердили и многократные возвратные скрещивания сегрегантов РеГ с родителем РеГ. Во всех случаях признак РеГ в тетрадах не проявлялся (рис. 8.5, б), в то время как по ядерным маркерам, введенным в скрещивание, наблюдали регулярное расщепление 2 : 2. При скрещивании вегетативных и генеративных мутантов РеГ образуются гибриды РеГ, в тетрадах которых происходит расщепление 2РеГ: 2РеГ.

Тетрадный анализ способности к дыханию у гибридов между гаплоидами дикого типа

Рис. 8.5. Тетрадный анализ способности к дыханию у гибридов между гаплоидами дикого типа: а - генеративными (ядерными); б - вегетативными (неядерными) /’еГ-мутантами

Вегетативные Pef-мутанты возникают спонтанно. Иногда они составляют до 1 % культуры. Их появление стимулируют высокая температура, акрифлавин, бромистый этидий в одинаковой степени у гаплоидов и диплоидов. При пересевах эти мутанты никогда не ревертируют к фенотипу Pet+ в отличие от генеративных Pei. Указанные воздействия не индуцируют генеративных мутантов Pei. Все это заставило предположить, что вегетативные Pei - результат потери некоего детерминанта, находящегося в цитоплазме, возможно, митохондрии. Открытие митохондриальной ДНК (мтДНК) позволило проверить это предположение.

Сравнение мтДНК из штаммов дикого типа и из вегетативных мутантов Pei показало, что последние несут делеции мтДНК различной протяженности вплоть до полной ее утраты. В дальнейшем в качестве генотипического символа обозначение pet сохранили только для рецессивных аллелей ядерных генов, которых теперь известно более 20. Митохондриальные мутации стали обозначать rh Позже мтДНК дрожжей была маркирована мутациями устойчивости к ряду антибиотиков (эритромицин, хлорам- феникол), подавляющих синтез белка у бактерий, а также устойчивости к агентам, подавляющим дыхание (олигомицин).

При генетическом анализе признаков, контролируемых мтДНК, обнаружился ряд особенностей поведения митохондриальных генов. При спаривании гаплоидных клеток, различающихся по аллелям какого-либо митохондриального гена, образуется популяция диплоидов, состоящая из клеток, получивших тот или другой аллель, причем в соотношении, характерном для скрещиваемых штаммов. Процент диплоидов, получивших определенный аллель, обозначают как частоту трансмиссии данного аллеля.

При исследовании рекомбинации митохондриальных геномов нужно учитывать, что в зиготе создается популяция молекул мтДНК, вступающих в многократные спаривания и обмены, аналогично тому, что известно о рекомбинации ДНК бактериофагов. При первых делениях зиготы эта популяция довольно быстро расщепляется, так что диплоидные вегетативные клетки содержат только один тип молекул мтДНК: один из родительских или рекомбинантный. При этом для некоторых маркеров наблюдается явление полярности рекомбинации, выражающееся в том, что нарушается равенство реципрокных рекомбинантных классов.

Явления разной трансмиссии и полярности рекомбинации маркеров осложняют количественную оценку частоты рекомбинации и картирование генов. Эффективным способом построения генетической карты митохондрий оказался метод, основанный на использовании г/го-мутаций, представляющих собой делеции. При этом исследуют частоту совместной потери или сохранения исследуемых маркеров у независимо полученных мутантов rho~. Таким способом определяют чередование маркеров на карте. Кроме того, существуют наборы штаммов дрожжей гЬоГ с физически охарактеризованными делениями мтДНК. Исследуемую мутацию и делецию объединяют при скрещивании и проверяют, возникают ли по исследуемому гену рекомбинанты дикого типа в постзиготических митозах. Отсутствие рекомбинантов означает, что деления захватывает изучаемый ген.

Если есть тестеры с перекрывающимися делениями, захватывающими как разные, так и одинаковые участки мтДНК, в сумме составляющими весь митохондриальный геном, то в качественном тесте можно картировать любую мутацию мтДНК (табл. 8.4). Карта митохондриального генома имеет кольцевую форму (рис. 8.6).

Карта митохондриальной группы сцепления 8асск. сегечЫае. Цифры внешнего круга маркируют участки общей шкалы в 100 единиц, которая соответствует 75 000 п.н

Рис. 8.6. Карта митохондриальной группы сцепления 8асск. сегечЫае. Цифры внешнего круга маркируют участки общей шкалы в 100 единиц, которая соответствует 75 000 п.н.

Выделение и исследование мтДНК позволило разрешить еще одну загадку вегетативных РеГ-мутантов, с которой столкнулись Б. Эфрусси и его коллеги (1955). При скрещивании клеток некоторых г/?о"-мутантов с клетками дикого типа с разной частотой (до 99 %) образуются диплоиды, не способные к дыханию. Это свойство, названное супрессией остью, стабильно наследовалось при вегетативном размножении и при скрещиваниях.

Таблица 8.4

Гены, картированные в митохондриальной группе сцепления у дрожжей

Ген

Контролируемый признак

СО

Фактор полярности рекомбинации

215

РНК большой субъединицы рибосом

cap

Устойчивость к хлорамфениколу

spi

Устойчивость к спиромицину

ery

Устойчивость к эритромицину

15 S

РНК малой субъединицы рибосом

tRNA

тРНК

25 генов:

cob

Апоцитохром Ь

oxil

Субъединицы

axil

Цитохром-с-

oxB

Оксидазы

olil

Субъединицы АТФазы,

oia J

мутации устойчивости к олигомицину

aap 1

Субъединица АТФазы

vari

Белок малой субчастицы рибосом

У зигот дрожжей можно индуцировать мейоз (что достигается простым перенесением их на среду с ацетатом калия или натрия) сразу после их образования от скрещивания клеток супрессивных л7го'-мутантов и клеток дикого типа. В этом случае мейоз происходит нормально и возможен тетрадный анализ (рис. 8.7), хотя после вегетативного почкования зигот и образования диплоидных клеток последние в 99 % случаев имеют фенотип Pei и уже не способны к мейозу и спорообразованию.

Тетрадный анализ супрессивности показывает отсутствие расщепления в подавляющем большинстве тетрад (0Pei* : 4.РеГ). Оказалось, что у высокосупрессивных мутантов сохраняется небольшой участок мтДНК с точкой начала репликации. Такие мини-кольца реплицируются быстрее нормальной мтДНК и быстро вытесняют ее при вегетативном делении клеток. Так называемые нейтральные гАо'-мутанты, не обладающие свойством супрессивности, вообще не содержат мтДНК. Это гАо-мутанты.

Генетика митохондрий лучше всего разработана для дрожжей- сахаромицетов, однако ряд примеров митохондриального наследования получен и у других объектов.

У Neurospora crassa мутация року (убогий, хилый) приводит к изменению морфологии митохондрий, нарушению в них белкового синтеза, отсутствию некоторых митохондриальных ферментов. Внешне это выражается в медленном росте штамма. Признак наследуется по материнской линии. Это можно установить благодаря доступности реципрокных скрещиваний у нейроспоры. Роль мужских гамет, практически не вносящих цитоплазму при оплодотворении, играют микроконидии. Мутация року", по-видимому, результат изменения митохондриального генома.

Наследование признака Pet' у дрожжей Saccli. cerevisiae в скрешивании rho~ х rho*

Рис. 8.7. Наследование признака Pet' у дрожжей Saccli. cerevisiae в скрешивании rho~ х rho*: а - нейтральный; б - супрессивный

У другого аскомицета - Podospora атеппа (жизненный цикл Р. атеппа и N. сгм5а сходен) - хорошо известен признак «старение мицелия», т. е. постепенное снижение жизнеспособности при непрерывном выращивании. Длительность жизни различных штаммов варьирует от 9 до 106 дней.

Старение наследуется по материнской линии. Его определяет инфекционное начало, как показали опыты по заражению нормального мицелия в результате его слияния со стареющей гифой (рис. 8.8). Показан фенотип культур, полученных из фрагментов: а - отсутствие роста, Ь - рост только в микрокапле, с - рост менее 2 см, а?- рост до 2-4 см, в - рост до 4-6 см,/- рост до 6-8 см, g- рост до 10-20 см, А - нормальная продолжительность жизни.

Изучение заражения нормального мицелия при слиянии его со стареющей гифой (черная) Ройозрога апзеппа

Рис. 8.8. Изучение заражения нормального мицелия при слиянии его со стареющей гифой (черная) Ройозрога апзеппа: а - состояние мицелия непосредственно после слияния; б-состояние мицелия через 12 ч, когда его разделили на фрагменты (показано стрелками)

Ускоренное старение наблюдали в участках мицелия, непосредственно прилегающих к точке анастомоза. По мере удаления от нее выраженность признака ослабевала. Старение гиф Р. апэегта обусловлено распространением плазмиды, инфицирующей митохондрии.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >