Тест-системы и система тестов генетической активности

Обилие химических соединений, которые по мере их появления необходимо проверять на генетическую активность, обусловило разработку простых, надежных и дешевых методов и тест-систем для скрининга, или просеивания, большого числа соединений. Для выявления мутагенов в этих тест-системах используются различные объекты и критерии. В настоящее время генетическая активность веществ определяется по следующим основным критериям:

  • 1) генным мутациям - заменам, вставкам и выпадениям пар нуклеотидов;
  • 2) конверсии;
  • 3) реципрокной, преимущественно митотической, рекомбинации;
  • 4) нерасхождению хромосом в митозе;
  • 5) хромосомным аберрациям;
  • 6) обменам между сестринскими хроматидами.

Кроме того, применяют такие критерии, как увеличение частоты доминантных признаков у дрозофилы и мышей и частота аномальных сперматозоидов у мышей. Последние два теста нельзя относить строго к генетическим, однако их результаты хорошо коррелируют с остальными тестами, основанными на критериях повреждения генетического материала.

В качестве объектов при массовом определении генетической активности тех или иных факторов используют культуры клеток человека и животных, высшие растения, микроорганизмы, О. melanogaster.

Тесты с использованием микроорганизмов отличаются большой пропускной способностью и чувствительностью к мутагенным воздействиям. Они позволяют в полной мере использовать преимущества селективных методов. Однако главная проблема при применении этих тестов - возможность экстраполяции получаемых результатов на человека. Проверка большого количества соединений на мутагенную активность с использованием млекопитающих, например мышей, невозможна по причине громоздкости и высокой стоимости экспериментов.

Решение проблемы было достигнуто при использовании теста на мутагенную активность, опосредованную метаболической системой хозяина. В первоначальном варианте этого теста потенциальные мутагены вводили в организм мышей или крыс, в перитонеальную полость которых помещали тест-микроорганизм: бактерии, дрожжи, конидии нейроспоры, - у которых затем учитывали мутации под влиянием мутагенов, активированных ферментами животных (табл. 13.2).

Таблица 13.2

Тест-системы для быстрой оценки генетической аюивности химических соединений

Объекты

Учитываемый эффект

Бактерии S. typhimurium E.coli

Реверсии His~ - His* Устойчивость Azc? - Azar Индукция профага X

Мутации:

Грибы

Sacch. cerevisiae

Реверсии ауксотрофных мутантов «незаконное» спаривание аХа митохондриальные мутации

Schiz. pombe Asp. nidulans

Реверсии ауксотрофных мутантов мутации по биосинтезу метионина

Рекомбинация:

Sacch. cerevisiae

Митотическая конверсия, митотический кроссинговер

Asp. nidulans

Митотический кроссинговер

Sacch. cerevisiae

Анеуплоидия и хромосомные перестройки: нерас- хождение хромосом в митозе анеуплоидов (учет по рецессивным селективным маркерам) делении и потери III хромосомы (система: аХа)

Asp. nidulans

Потери хромосом в митозе у диплоидов у/+

Высшие растения Традесканция Бобы

Хромосомные аберрации в кончиках корня

Соматические мутации:

О. melanogaster

Мозаичность крыльев и глаз

Культура клеток млекопитающих Гепатощлы крыс и др.

Одноцепочечные разрывы ДНК Внеплановый синтез ДНК

Человек

Лимфоциты человека

Цитогенетические эффекты: хромосомные аберрации, обмены между сестринскими хроматидами Генные мутации устойчивости

В дальнейшем мутагенез, опосредованный метаболической системой хозяина, был упрощен и стал проводиться in vitro. Для этого мутаген наносят на чашки Петри, засеянные тест-объектом, в смеси с ферментами мик- росомной фракции клеток печени мыши или крысы. В этой фракции, обозначаемой S9, находится цитохром Р450, главная функция которого в организме - детоксикация чужеродных соединений. Действуя на некоторые так называемые промутагены, система микросомного окисления превращает их в мутагены.

В системах с метаболической активацией промутагенов используют не только микросомную фракцию печени, но и кровь или мочу животных и человека, а также экстракты из тканей высших растений.

Благодаря использованию детально разработанных мутационных систем у микроорганизмов открываются большие возможности не только для тестирования мутагенной активности различных соединений, но и для выяснения механизма их действия. При этом используют мутантов с генетическими изменениями определенной молекулярной природы. Так, широкое применение нашла тест-система, разработанная Б. Эймзом на основе Яи'-мутантов 5. ГурИутипит. Он использовал несколько мутантов типа замены пар оснований, а также типа вставок-выпадений пар оснований по гистидиновому оперону. Мутации объединяются с делецией по одному из генов, контролирующих эксцизионную репарацию, что повышает чувствительность теста в несколько сотен раз. В геном тех же штаммов введена мутация, блокирующая образование липополисахаридной капсулы бактерий, благодаря чему повышается проницаемость клеток. В клетки введены также плазмиды - Л-факторы, которые способствуют выявлению мутаций, возникающих как ошибки рекомбинации.

Мутагенный эффект испытываемых соединений определяется в так называемом спот-тесте, для чего на чашки Петри без гистидина, засеянные тест-штаммом, наносится исследуемое вещество вместе с микросомной фракцией гомогената печени мыши для активации мутагенов. Появление Яи"-ревертантов свидетельствует о генетической активности испытываемого агента.

Благодаря использованию этой системы показана тесная корреляция мутагенной активности и канцерогенное™ многих соединений, т. е. выявление генетической активности соединения одновременно с большой вероятностью указывает на то, что оно потенциальный канцероген. Б. Эймз показал мутагенную активность ряда веществ, применяемых в качестве консервантов пищи, ряда красителей для волос, сигаретного пепла, грибных токсинов (в частности, афлатоксинов), бенз(а)пирена и др.

В дальнейшем подход, разработанный Б. Эймзом, нашел применение и в работе с другими микроорганизмами: бактериями, дрожжами.

При изучении мутагенеза под действием факторов, загрязняющих окружающую среду, необходимо испытывать сложные смеси веществ, включающие органические и неорганические молекулы. Кроме того, даже зная химическую структуру соединения, трудно предсказать характер его мутагенной активности. В связи с этим для испытаний предложено использовать набор штаммов одного и того же микроорганизма, несущих мутации известной молекулярной природы и специфически реагирующих на действие эталонных мутагенов. Среди таких мутагенов, применяемых в эксперименте в качестве обязательного позитивного контроля, используются ультрафиолетовый свет, этилметансульфонат, нитрозосоединения, р-пропиолактон, 6-гидроксиламинопурин и т. д. В таких тестах выявление мутагенной активности загрязнителей окружающей среды позволяет грубо оценивать механизм действия активного начала. Кроме того, применение серии штаммов с различной локализацией мутации позволяет минимизировать «эффект контекста» на мутагенез. Известно, что мутации одинаковой природы происходят с неодинаковой частотой в различных участках даже одного и того же гена.

Наряду с прокариотическими микроорганизмами (бактериями) в тест- системах часто используют эукариотические микроорганизмы: грибы, дрожжи ЗассИ. сегес(з1ае, БсЫг. ротЬе, нейроспору и аспергилл, в меньшей степени - водоросли и простейших. У дрожжей, как и у бактерий, учитывают прямые и обратные генные мутации, применяют метаболическую активацию, а кроме того, дрожжи сами активируют многие промутагены. В дополнение к этому у дрожжей исследуют внутригенную рекомбинацию (конверсию) и реципрокную рекомбинацию в митозе. На основе генетических критериев у этого объекта учитывают также хромосомные аберрации - потерю плеча или всей III хромосомы, а также нерасхождение хромосом. Последний эффект удобнее исследовать у аспергилла, для которого хорошо разработаны методы анализа нерасхождения хромосом, приводящие к гап- лоидизации в парасексуальном цикле.

Генетическая токсикология не ограничивается в исследованиях только микроорганизмами. Большой практический интерес представляют мутагенные эффекты у многоклеточных животных и в клетках человека. В качестве многоклеточного животного используют дрозофилу, у которой учитывают доминантные летали нерасхождения и потери хромосом в мей- озе, митотический кроссинговер и возникновение мутаций в соматических клетках. В последнем случае действуют мутагеном на личинок и изучают мозаичность глаз или крыльев как результат появления мутантных клонов в ходе дифференцировки имагинальных дисков.

К числу быстрых тестов с использованием высших растений относится учет хромосомных аберраций в корешках традесканции и др.

Наиболее адекватной тест-системой должна служить культура клеток человека, в которой учитывают хромосомные аберрации и обмены между сестринскими хроматидами, современный метод анализа которой предложили в 1972 г. А.Ф. Захаров и Н.А. Еголина. При репликации хромосом лимфоцитов периферической крови человека в присутствии 5-бромдезоксиуридина (БДУ) этот аналог включается на место тимидина. Если БДУ дают только в течение одного клеточного цикла, то меченой после второго цикла будет только одна хроматида из двух, если же БДУ находится в среде в течение двух клеточных циклов, то мечеными к концу второго цикла будут обе хроматиды (рис. 13.1): одна по обеим комплементарным цепям ДНК, а другая только по одной. Обнаружить различие хро- матид (содержащих тимидин и БДУ) удается только с помощью красителей: азурэозина, красителя Гимза, акридинового оранжевого и др., а также при исследовании флуоресценции хромосом с БДУ. После окраски акридиновым оранжевым хроматиды, не содержащие брома, светятся в зеленой части спектра, а включившие бром - в красной.

Включение 5-бромдезоксиуриднна (БДУ) в ДНК в зависимости от присутствия БДУ в течение

Рис. 13.1. Включение 5-бромдезоксиуриднна (БДУ) в ДНК в зависимости от присутствия БДУ в течение: а - одного ц икла репликации; б - двух циклов репликации;

I- первая репликация, II - вторая репликация

Увеличение частоты сестринских обменов при действии какого-либо агента указывает на его генетическую активность (рис. 13.1).

В культурах клеток человека учитывают также генные мутации, например по локусу тимидинкиназы. Этот эксперимент занимает от двух до пяти недель. Время, необходимое для обнаружения других генетических событий и у других объектов, легко установить, зная их особенности. Эксперименты с бактериями при качественном или полуколичественном учете генетической активности занимают одну неделю. При количественном исследовании мутагенной активности с применением системы метаболической активации это время увеличивается до 4-5 недель. Сходные затраты времени необходимы для работы с грибами: дрожжами и нейроспорой. Сравнимые сроки требуются для испытаний с использованием дрозофилы (2-7 недель) и высших растений.

Несмотря на высокую разрешающую способность всех перечисленных тест-систем, наибольшие возможности для экстраполяции получаемых результатов на человека представляют исследования с млекопитающими in vivo: с мышами, крысами, хомячками. Это связано со специфичностью действия мутагенов, с разными мутагенными эффектами на соматических и генеративных клетках, а также с различиями соматических клеток in vitro и in vivo. Наиболее информативны результаты в тестах на мутагенез в специфическом локусе. Правда, при таком подходе требуется большое число животных, следовательно, резко возрастает стоимость исследований.

С учетом этих обстоятельств встает проблема разработки не только чувствительных тест-систем, которых появляется все больше, но и системы тестов (рис. 13.2). Многими исследователями предложены различные варианты ступенчатых систем тестирования мутагенов и промутагенов, основу которых составляет скрининг, или просеивание большого числа веществ на системах, позволяющих быстро оценить их генетическую активность. Последующие этапы включают все меньшее число агентов, которые исследуются более подробно.

Система тестирования лекарственных препаратов с целью выявления их генетической активности

Рис. 13.2. Система тестирования лекарственных препаратов с целью выявления их генетической активности

Большое значение для оценки последствий загрязнения окружающей среды генетически активными факторами имеет наблюдение за природными популяциями растений, животных и микроорганизмов. Такой постоянный контроль (мониторинг) изменений генетической структуры природных популяций позволяет улавливать изменения и прогнозировать их дальнейшие последствия. Кроме того, в условиях загрязнения многие из перечисленных систем могут быть использованы в качестве чувствительных биологических дозиметров мутагенной опасности, что особенно относится к культурам микроорганизмов с генетическими нарушениями систем репарации.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >