Гибридизация нуклеиновых кислот

Реакцию гибридизации используют в генетической инженерии для создания гибридных молекул ДНК, а также как эффективный метод для выявления определенных последовательностей в ДНК и РНК. Если водный раствор ДНК нагреть до температуры 96-100 °С и сильно защелочить (pH > 13,0), то ДНК диссоциирует на отдельные цепи. Этот процесс денатурации ДНК обратим, поскольку если две изолированные цепи ДНК выдерживать определенное время при 65 °С, то они вновь спариваются, образуя двойную спираль, что и называют ренатурацией, или гибридизацией (отжигом). Гибридизация может идти между одинарными цепями ДНК и/или РНК (конечно, если они имеют комплементарные последовательности нуклеотидов), что приводит к образованию двойных цепей (дуплексов) разного состава: ДНК : ДНК; РНК : РНК; ДНК : РНК.

При конструировании гибридных ДНК гибридизация нуклеиновых кислот реализуется как правило в двух основных стратегиях (методах) получения рекомбинантных ДНК: коннекторной и рестриктазно-лигазной.

Коннекторный метод (рис. 15.2) создает условия для гибридизации продуктов рестрикции разных геномов путем наращивания на их концах комплементарных олигонуклеотидных участков. Гибридизация (отжиг) этих ферментов ведет к образованию гибридных молекул ДНК. В этом методе используют 3 фермента: 5'-экзонуклеазу, терминальную нуклеотидил- трансферазу и ДНК-лигазу. Именно этим методом П. Берг и сотрудники получили в 1972 г. первую гибридную молекулу ДНК.

Схема контрольного метода получения гибридных молекул ДНК

Рис. 15.2. Схема контрольного метода получения гибридных молекул ДНК

Рестриктазно-лигазный метод (рис. 15.3) наиболее прост и популярен в генетической инженерии. В этом методе с использованием одной рестриктазы II, дающей фрагменты рестрикции с «липкими концами», гибридизация между фрагментами хромосомной ДНК и ДНК-плазмидой осуществляется без дополнительной процедуры наращивания комплементарных концов. После окончания гибридизации остается только сшить поли- нуклеотидные фрагменты с помощью ДНК-лигазы.

Схема рестриктазно-лигазного метода получения гибридных молекул ДНК

Рис. 15.3. Схема рестриктазно-лигазного метода получения гибридных молекул ДНК

Гибридизацию используют для нахождения числа определенных нуклеотидных последовательностей (генов) в ДНК. Для этой цели применяют ДНК -зонды - радиоактивные фрагменты ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Метку в зонд вводят путем ник-трансляции. Это очень точный метод, который позволяет выявить один ген в клетке. Так выявляют отдельные (уникальные гены), а также гены, представленные в геноме десятками или сотнями копий.

Для локализации специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках используют гибридизацию in situ. При этом ДНК-зонды гибридизуют с хромосомами после кратковременного воздействия щелочью. Далее места гибридизации выявляют с помощью радиоавтографии. Применяют не только радиоактивные, но и химически меченные ДНК-зонды. Для этого при синтезе зонда используют нуклеотиды, содержащие боковую цепь биотина, которую после гибридизации окрашивают стрептовидином. С помощью гибридизации in situ можно выявить локализацию определенных видов мРНК в клетках и таким образом судить о дифференцировке в клетках эмбриона. Популярной биологической моделью таких исследований являются эмбрионы плодовой мушки дрозофилы.

Гибридизацию используют для выявления транскрибируемых и не- транскрибируемых последовательностей в ДНК. При этом анализируются продукты гибридизации ДНК и матричных РНК, что позволяет выявить активные (транскрибируемые) участки в молекулах ДНК.

Гибридизация широко используется для выявления определенных нуклеотидных последовательностей в смеси рестрикционных фрагментов. Такой прием носит название блоттинг (от англ, blot - промокать). Рестрикционные фрагменты фракционируют методом электрофореза (применяют высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности CsCl с использованием этидия бромида). Это позволяет разделить до 500 фрагментов, отличающихся по размерам всего на один нуклеотид. Затем гель агарозу совмещают с листом нитроцеллюлозной бумаги. В результате диффузии фрагменты частично переходят на этот лист, и таким образом получается отпечаток (реплика) с геля. Затем методом радиоавтографии с использованием радиоактивного ДНК-зонда определяют на реплике положение фрагментов, которые гибридизуются с зондом.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации (от лат. ampliticatio - распространение, увеличение) фрагментов нуклеиновых кислот in vitro. С его помощью можно достаточно быстро получить миллионы копий сегментов ДНК или РНК, даже когда они присутствуют в препарате в виде единственной молекулы.

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных двум З'-концам участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. Для осуществления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который желательно амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (7ад-полимеразу), которая в присутствии всех четырех видов нуклеотидов и коротких 20-30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК.

Вначале осуществляют термическую денатурацию (расплетание) двухцепочечной молекулы (фрагмента) ДНК при 93-95 “С, что приводит к разделению комплементарных цепей. Затем пробы охлаждают до 60 °С, что дает возможность связаться праймерам и одноцепочечным дезоксиолиго- нуклеотидам, а Гад-полимеразе - включиться в работу.

Праймеры обычно получают методом химического синтеза, определив предварительно нуклеотидную последовательность пограничных с амплифицируемым геном участков ДНК. Праймеры подстраиваются сами (по комплементарному принципу) к денатурированным нагреванием гомологичным участкам одноцепочечных фрагментов исходной «материнской») ДНК. Они служат, по существу, для двух целей: во-первых, запускают работу ДНК-полимеразы, во-вторых, ограничивают ее действие, как бы застопоривают фермент в рамках нужного участка копирования ДНК.

ПЦР имеет циклический характер (рис. 15.4). В первом и частично во втором циклах образующиеся копии (ампликоны) ДНК не соответствуют границам амплифицируемого гена (все ампликоны в первом цикле и часть ампликонов во втором цикле получаются более протяженными в тех участках, где еще не произошло связывание второго - «антисмыслового» - праймера). Однако начиная уже с третьего цикла длина ампликонов становится стандартной, т. е. соответствует числу пар нуклеотидов фрагментов ДНК-матрицы между З'-концами праймеров. Ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии и начинают доминировать среди продуктов амплификации. Процесс имеет цепной характер, т. к. синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез.

Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Рис. 15.4. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

При многократном повторении циклов синтеза (включающих нагревание и охлаждение проб в вышеназванных пределах температур) число копий специфических фрагментов ДНК экспоненциально увеличивается. Это позволяет из небольшого числа имеющихся фрагментов получить множество копий, которые можно идентифицировать методом электрофореза. Повторяя циклы амплификации 30-40 раз, за 1,5-3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Результаты, достигаемые с помощью ПЦР, позволили этому методу занять ведущее место в молекулярной биологии как по популярности использования в научных исследованиях фундаментального характера, так и по практическому применению в медицинских целях.

Очень важно применение ПЦР при определении характера мутаций. После того как ген клонирован, с помощью двух праймеров амплифициру- ют соответствующий геномный сегмент, полученный от разных особей данного вида. Секвенирование этого сегмента позволяет установить природу мутации, произошедшей в данном гене, или выявить полиморфизм, будь то замена одной пары оснований или делеция, инсерция или перестройка. Благодаря простоте метода с его помощью можно диагностировать генетические заболевания и проводить популяционно-генетические исследования.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >