Клонирование ДНК

Клон вируса или клеток - это некая популяция, каждый член которой ведет происхождение от одного репродуцирующегося вириона или от одной клетки соответственно. Все члены клона независимо от того, являются ли они вирусами или клетками, по существу, идентичны вирусу или клетке, которые дали начало клону; они также идентичны друг другу. С помощью клонирования получают чистый препарат одного генома, поскольку все члены клона содержат идентичные ДНК. Эта концепция молекулярного клонирования используется и при получении чистых препаратов определенных молекул рекомбинантных ДНК.

В основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна переносить в клетку чужеродную ДНК и обеспечивать там ее амплификацию. В качестве векторов чаще всего используют бактериальные плазмиды, бактериофаги и вирусы животных. Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, встречающиеся в клетках бактерий и дрожжей, где они реплицируются в процессе пролиферации клеток как самостоятельные единицы.

При работе с Е. coli чаще всего используют плазмиду pBR322 (рис. 15.5). Этот вектор был сконструирован с помощью классических генетических методов (in vivo) и методов, применяемых при работе с рекомбинантными ДНК, и имеет многие свойства идеального плазмидного вектора д ля клонирования. Установлена полная нуклеотидная последовательность этого вектора. Кроме того, плазмида содержит два селективных маркера: гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Каждый из 12 сайтов узнавания рестриктазами встречается в молекуле лишь 1 раз, и это позволяет получать полноразмерные линейные молекулы с разнообразными «липкими концами». В норме в клетке Е. coli может содержаться до 50 копий плазмиды pBR322. Клетки Е. coli, содержащие данный вектор, выращивают в среде с ампициллином или тетрациклином, на которой клетки, не имеющие эту плазмиду, не растут. Таким образом, на такой селективной среде накапливаются только те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК. Это свойство облегчает выделение больших количеств рекомбинантной плаз- мидной ДНК.

Схема строения плазмидного вектора pBR322

Рис. 15.5. Схема строения плазмидного вектора pBR322: ori - точка начала репликации; Атр Те г - гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину; R - репликон; /?; Pu, Е, Я... - сайты рестрикции различных рестриктаз (цифры обозначают число нуклеотидных пар)

Обычный размер плазмиды - 3-10 тыс. нуклеотидных пар. Некоторые плазмиды обладают еще одной важной особенностью: если на клетки, в которых присутствует такой вектор, подействовать антибиотиком хло- рамфениколом, то число копий плазмиды в них возрастет от нескольких штук до 3 000. При этом увеличивается доза нужного гена, что позволяет получать вставленный в плазмиду ген (или продукт этого гена) в больших количествах. В плазмиду можно вставлять фрагменты чужеродной ДНК размерами не более 10-15 тыс. пар нуклеотидов.

Когда нужно клонировать более крупные фрагменты ДНК, удобнее использовать векторы на основе умеренного бактериофага X.

Генетическая карта фага X дикого типа с указанием сайтов рестрикции для рестриктаз представлена на рис. 15.6. Молекула ДНК фага X содержит область начала репликации, а также гены структурных вирусных белков (головки и хвостового отростка) и ферментов, участвующих в репликации ДНК, лизисе инфицированных клеток и установлении лизогении. Фаг X очень пластичен: без нарушения развития фага из него можно убрать до 25 % ДНК или пристроить до 6 % лишней ДНК. В этот фаговый вектор можно встраивать до 23 тыс. нуклеотидных пар.

Линейный геном бактериофага X

Рис. 15.6. Линейный геном бактериофага X: светлый овал - область начала репликации; Р-ЕсоН - сайты; заштрихованная часть - гены, необязательные для литической инфекции

Плазмиды и бактериофаги - наиболее часто используемые векторы. Но существуют и другие типы векторов со своими преимуществами. Прежде всего это космиды - векторы, полученные путем объединения небольших фрагментов бактериофага X и плазмид. Они содержат гены, позволяющие им размножаться в бактерии, ген устойчивости к тетрациклину и особый участок ДНК из бактериофага X под названием COS, который содержит все необходимое для упаковки рекомбинантной ДНК в белковую головку фага. Космиды позволяют получать гибридные молекулы с длиной вставки в 35-40 тыс. пар нуклеотидов.

С помощью космид и всех вышеназванных векторов гены вводят в бактериальные клетки. Для клеток животных и человека они непригодны. Дело в том, что молекулярные механизмы реализации генетической информации у прокариот и эукариот различны, и бактериальная плазмида не способна размножаться в животной клетке.

В качестве векторов животных и человека используются различные вирусы. Так, вектор на основе вируса SV40 увеличивает число введенных генов до 100 тыс. молекул на клетку. Применяют векторы на основе вирусов папилломы, герпеса, осповакцины, адено- и ретровирусов. Особенность структуры ретровируса - наличие длинных концевых повторов на концах молекулы ДНК-вируса. Эти повторы и дают возможность гибридной молекуле встроиться в хромосому клетки-хозяина.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >