Химико-ферментативный синтез полинуклеотидов

В 1970 г. в США в лаборатории Х.Г. Кораны впервые был осуществлен синтез гена. Это был цистрон, кодирующий дрожжевую тРНК/,й, состоящий из 77 пар нуклеотидов. Синтез осуществляли ступенчато, присоединяя нуклеотиды один за другим. Полученные химическим синтезом фрагменты соединяли между собой с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Позднее Х.Г. Корана синтезировал ген тирозиновой супрессорной РНК, состоящей из 207 нуклеотидов.

Химический синтез гена стал крупнейшим достижением биооргани- ческой химии и молекулярной биологии. Он открыл путь прямого получения необходимых генов для технологии рекомбинантных ДНК и стал важным условием прогресса генетической инженерии.

Метод, разработанный Х.Г. Кораной, был затем применен для синтеза генов гормонов инсулина и соматостатина.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Инсулин - небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника - препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клегке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А- и ss-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Генно-инженерное получение инсулина началось в конце 70-х гг. XX в. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. coli (рис. 15.10). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к З'-концу гена фермента ss-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli,

трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента ss-галактозидазы и А- или ss-пептида инсулина, присоединенного к плазмиде Е. coli через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом.

Схема синтеза инсулина

Рис. 15.10. Схема синтеза инсулина

В 1981 г. синтезирован ген-аналог проинсулина - мини-С-проинсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: А-А-Г-С-А-А-; показана его экспрессия в Е. coli.

Сотрудниками института биоорганической химии под руководством академика Ю.А. Овчинникова был осуществлен синтез двух структурных генов, кодирующих синтез нейропептидов: лейцин-энкефалина и брадики- нина. Синтезированный ген лейцин-энкефалина имел два «липких конца» (рис. 15.11).

Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагментом природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка ss-галактозидазы кишечной палочки, в плазмиду-вектор pBR322 и обработан смесью рестриктаз - ЕсоШ и BamHl. Полученная рекомбинантная плазмида рЕк была трансформирована в клетки кишечной палочки. В результате экспрессии встроенного гена (рис. 15.11) бактерия начала продуцировать гибридный (химерный) белок, содержащий на одном конце участок р-галактозидазы, а на другом - С-конце - последовательность нейропептида. С помощью бромциана химерный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энкефалин.

Схема синтеза гибридного и активного лейцин-энкефалина

Рис. 15.11. Схема синтеза гибридного и активного лейцин-энкефалина

Химический синтез полидезоксирибонуклеотидов в настоящее время практически полностью автоматизирован. Его проводят на установках, называемых синтезаторами ДНК.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >