Рекомбинантные ДНК

Рекомбинантная ДНК - это искусственно полученная ДНК, которая включает ген (гены), являющийся объектом генетических манипуляций, и вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном.

Векторы должны обладать следующими особенностями:

  • - иметь свойства репликона;
  • - нести субстратные участки для рестриктаз, без чего невозможна встройка ДНК;
  • - содержать один или несколько генов-маркеров, позволяющих по фенотипу констатировать факт его передачи.

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК началось с получения гибридных ДНК между плазмидами. В 1978 г. М. Коеном был проведен опыт, в котором удалось создать новую гибридную плазмиду, объединившую устойчивость к антибиотикам, которой обладали молекулы ДНК объединяемых плазмид.

Схема получения рекомбинантной плазмиды и ее клонирования в клетках бактерий приведена на рис. 15.13.

Получение рекомбинантной плазмиды и ее клонирование в клетках бактерий

Рис. 15.13. Получение рекомбинантной плазмиды и ее клонирование в клетках бактерий

Получены многочисленные факты переноса генов из клеток эукариот в клетки бактерий. Дж. Морроу и его сотрудники (1974) использовали в качестве вектора ДНК плазмиды pSClOl Е. coli и в качестве переносимого ген-специфичного материала - фрагмент ДНК из хромосомы африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), кодирующий синтез молекул рибо- сомной ДНК.

Фрагменты ДНК, детерминирующие синтез молекул рРНК (фрагменты рДНК), «пришивались» к плазмиде. Затем гибридными молекулами трансформировали Е. coli по признаку устойчивости к тетрациклину. Из клеток трансформантов выделяли плазмидную ДНК, изучали ее в градиенте плотности хлористого цезия, под электронным микроскопом проверяли ее способность к гибридизации с меченой рибосомной РНК X laevis и исследовали, на какое число фрагментов она распадается под действием рестриктаз. Все тесты показали наличие генетического материала X. laevis в плазмидах, способных к репликации в клетках бактерии. Кроме того, была исследована способность этого материала, включенного в ДНК плазмиды, к транскрипции. Для этой цели были использованы так называемые миниклетки, т. е. бактериальные клетки одного из мутантов, не содержащие в определенных условиях ДНК. Опыты показали, что в мини-клетках, трансформированных рекомбинантными плазмидами, осуществляется транскрипция генов из ДНК X. 1аеук.

В последующие годы ряд генов человека был введен в клетки бактерий, с помощью которых синтезировали нужные белки человека (рис. 15.14).

Основные этапы производства белка методами генной инженерии

Рис. 15.14. Основные этапы производства белка методами генной инженерии: а - экстракция мРНК определенного гена; б - копирование экстрагированной мРНК в кДНК ферментом ревертазой; в - интеграция кДНК в соответствующий вектор, обычно плазмиду; г - введение рекомбинантных плазмид в клетки бактерии Е. coir, д - выделение из популяции трансформированных бактерий клона с нужной кДНК для продуцирования соответствующего белка

Непосредственное клонирование геномной ДНК все еще остается технически трудной задачей. Экспериментатор, желая выделить какой-либо ген, располагает для начала тремя источниками: белками, мРНК и геномной ДНК. Основой пока остается процедура, позволяющая по мРНК воспроизводить ДНК.

В качестве примера рассмотрим клонирование генов факторов крови. Сначапа находят орган, в котором выделяемый ген экспрессируется активнее всего, т. е. уровень соответствующей мРНК в нем самый высокий.

После экстракции мРНК из такой ткани приступают к получению с мРНК ДНК-копий (комплементарной ДНК, или кДНК) с помощью обратной транскриптазы. Комплементарная ДНК намного более стабильна, чем соответствующая мРНК. Кроме того, в двухцепочечном виде ее можно интегрировать в плазмиду (бактериальную мини-хромосому), которую в свою очередь вводят в бактерию типа Е. coli. Такие плазмиды, используемые сейчас во всех лабораториях, где проводят работы по генной инженерии, происходят от дикого типа и несут в большинстве своем по два гена устойчивости к антибиотикам (например, к пенициллину и тетрациклину). Эти маркеры позволяют отбирать те бактерии, которые содержат плазмиду, а среди них в свою очередь те, у которых плазмида включила в себя кДНК. Поскольку кДНК встраивается внутрь гена устойчивости к пенициллину, такой «раздробленный» ген уже не работает, и бактерии вновь обретают чувствительность к антибиотику. Устойчивость же к тетрациклину при этом сохраняется. Следовательно, достаточно высеять бактерии на питательную среду с тетрациклином, чтобы отобрать из них содержащие плазмиду, а затем из последних - содержащие так называемую рекомбинантную плазмиду и чувствительные к пенициллину. Таким образом и получают соответствующий «банк кДНК».

Следующий этап состоит в том, чтобы среди 104-105 независимых бактериальных колоний определить те, которые содержат генетическую информацию об интересующем нас гене несвертывания крови.

Для того чтобы среди десятков тысяч бактериальных колоний банка кДНК найти ту, которая содержит кДНК нужного белка, приходится использовать несколько методов, т. к. ни один из них в отдельности не гарантирует успеха. Один из этих методов заключается в использовании синтетического зонда, гомологичного нужной молекуле кДНК. Такой меченый зонд гибридизируется с кДНК, так что метка вводится во всю колонию. Разработано также несколько упрощенных методик, использующих ту или иную априорную информацию.

Предположим, что известны лишь фрагменты аминокислотной последовательности этого белка. Зная генетический код, химик может синтезировать соответствующие им фрагменты ДНК длиной 14-18 п. н. Пометив их радиоактивным фосфором 32Р, биолог может воспользоваться ими как молекулярным зондом для выявления тех бактериальных клонов, которые содержат соответствующую кДНК. Метод основывается на том, что кДНК гомологичных последовательностей способны связываться друг с другом. Колонию с кДНК, гомологичной какому-либо из меченых фрагментов, теперь легко определить после соответствующей экспозиции фотопленки.

За последние годы эта методика была существенно усовершенствована во многом благодаря успехам в химическом синтезе ДНК.

Получение кДНК человека возможно в два этапа: после выделения гомологичной кДНК какого-либо животного ее уже можно использовать в качестве зонда. Две молекулы кДНК, например мыши и человека, способны соединяться так же эффективно, как и в случае двух близкородственных млекопитающих.

Ситуация усложняется, если аминокислотная последовательность не известна. Методика исследования в этом случае сводится к тому, чтобы заставить бактерии непосредственно считывать содержащуюся кДНК, затем выявлять такие колонии специфическими антителами.

Способность кДНК связываться с мРНК также нашла применение. После гибридизации каждую мРНК элюируют (осаждают с помощью электрофореза), затем с нее считывают белок либо в бесклеточной системе, либо (после инъекции) в яйцеклетке земноводного. Белок характеризуют по его молекулярным свойствам и биологической активности.

Ученые разрабатывают новые методы, ускоряющие выделение клонов. Стало очевидным, что при выделении клонов следует использовать несколько методов одновременно. При таком подходе нужный клон кДНК всегда можно будет выделить.

После клонирования начинается «эксплуатация» кДНК. Ее подробное исследование позволяет быстро определить первичную структуру соответствующего белка. В большинстве случаев кДНК непосредственно используют для производства «своего белка». Но можно ее заменить, воспользоваться ею для выделения самого гена из банка геномной ДНК (методом гибридизации). Изучение самих генов позволяет лучше понять их структуру и механизмы действия в организме.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >