Методы создания гаплоидных растений

Создание гаплоидных растений играет важную роль в эволюции растительного мира. С момента открытия и изучения гаплоидии на нее возлагали надежду как на самую перспективную возможность в селекции. Экспериментальная гаплоидия позволила получить гаплоидные растения большинства возделываемых культур, но в селекционной практике используются лишь те виды, для которых разработаны способы массового получения гаплоидных растений.

Спонтанное возникновение гаплоидов в природе — редкое явление, которое варьирует, как правило, от десятитысячных до десятых долей процента. Для получения гаплоидов применяются различные методы: отдаленная гибридизация, внутривидовая гибридизация, температурные воздействия, метод ионизирующей радиации, метод близнецов, химический метод, культура мужского и женского гаметофитов.

Отдаленная гибридизация — один из первых изученных способов получения гаплоидных растений, который в настоящее время для некоторых культур остается достаточно эффективным способом индуцирования гаплоидии. Этим способом впервые были получены ма- троклинные гаплоиды N. tabacum путем скрещивания N. tabacum х х N. sylvestris в первом поколении. Способом отдаленных скрещиваний получены гаплоиды Brassica nigra и Solanum tuberosum.

Получение гаплоидов путем внутривидовой гибридизации основано на анализе генотипов отцовской и материнской формы и подборе генотипов, которые обеспечивают высокую частоту образования гаплоидов. Впервые такие формы были получены для кукурузы в 1959 г.

Температурные воздействия также являются методом инициации гаплоидии. Однако в случае применения данного метода были получены лишь единичные гаплоиды для таких культур, как кукуруза, табак и рожь. Например, этим способом Л. Рандольф в 1923 г. индуцировал гаплоидию у Z. mays путем обработки материнских растений через сутки после опыления температурой +43 °С.

Другим методом получения гаплоидов является применение ионизирующей радиации. Впервые облучение семян, растений и пыльцы было применено в 1931 г. для индуцирования гаплоидии у кукурузы. Первые гаплоидные растения кукурузы были получены Я. Катаяма в 1934 г. путем опыления пыльцой, облученной рентгеновским излучением (Х-излучением). В результате облучения, мужские гаметы инактивировались. Ослабление происходило настолько, что мужские гаметы теряли способность к слиянию с яйцеклеткой, но при этом стимулировали ее к делению с последующим образованием гаплоидного зародыша. Кроме того, облучение пыльцы в стадии гаметогенеза могло ингибировать деление генеративного ядра, в результате чего формировалась пыльца с одним реституционным спермием, которая обеспечивала возможность партеногенетического развития яйцеклеток. Таким методом получены в 1990 г. гаплоидные растения кукурузы, в 1955 г. мягкой пшеницы. Облучение гамма-излучением показало наибольшую эффективность, но необходимо обязательное условие, чтобы материнские формы обладали склонностью к автономному апомиксису.

Близнецовый метод заключается в поиске и отборе гаплоидных близнецов. Близнецами называют пары или группы самостоятельных растений, полученных из одного семени. Одни авторы объясняют возникновение близнецов закладкой в одной семяпочке двух или нескольких зародышевых мешков, один из которых оплодотворяется нормально, а другой начинает свое развитие без оплодотворения, под влиянием первого. Это впервые показано на Oryza sativa в 1935 г. Другое мнение о возникновении близнецов состоит в том, что гаплоидный близнец возникает в результате формирования зародыша из синергид или антипод зародышевого мешка. Функционируют оба пути развития зародыша, кроме того, выделяют разделение на ранних этапах эмбриогенеза одного зародыша на несколько. Хорошо это показано на картофеле.

Другой способ, обеспечивающий повышение частоты возникновения гаплоидов, основан на химическом воздействии. В ряде случаев при обработке семян, соцветий или пыльцы химическими веществами происходит повышение частоты образования гаплоидов. Так, обработка рылец кукурузы до опыления гидразидом малеиновой кислоты (50 мг/л), в опытах Е. Динон увеличивала частоту гаплоидов с 1:400 до 1:143. Гидразид малеиновой кислоты (40 мг/л) в сочетании с 2%-ным диметилсульфоксидом (ДМСО) оказался эффективным и для индуцирования гомозиготных диплоидов кукурузы. О химическом индуцировании апомиктического образования семян у гибридов кукурузы с использованием регуляторов роста и ДМСО сообщили также Г. Ху, Г. Лианг и С. Вассон. Большинство полученных ими растений оказались диплоидами, некоторые — миксоплоидами и лишь немногие — гаплоидами. Диплоидные растения были морфологически однородны и сходны с родителями. Они возникали, по предположению авторов, из соматической ткани семяпочки, а гаплоиды — из редуцированных клеток зародышевого мешка. Таким образом, была показана и возможность химической индукции добавочных зародышей у кукурузы.

Е. В. Гришина и М. И. Зайцева (1968) изучали влияние физиологически активных веществ на частоту гаплоидов кукурузы. Были исследованы индолилмасляная, индолилпропионовая, индолил- триуксусная и а-нафтилуксусная кислоты — в концентрации 0,1 % и новокаин — в концентрации 0,5 %. Химические вещества наносились на рыльца материнских растений путем опрыскивания. Наибольшее повышение частоты гаплоидов авторы обнаружили при обработке рылец индолилтриуксусной кислотой (до 1:1550) и а-нафтилуксусной кислотой (до 1:913) — за сутки до опыления и новокаином (до 1:242) — через сутки после опыления. В контроле гаплоиды не формировались. Возрастание частоты гаплоидии при обработке рылец физиологически активными веществами, видимо, объясняется тем, что они стимулировали яйцеклетки к делению без оплодотворения, а последующее опыление обеспечивало возможность формирования эндосперма и апомиктического развития зародыша. Новокаин, нанесенный на рыльца через сутки после опыления, по всей вероятности, нарушал процесс двойного оплодотворения, ограничивая его оплодотворением центрального ядра зародышевого мешка. Повышение частоты гаплоидии у сортов кукурузы в опытах Е. В. Гришиной и М. И. Зайцевой отмечено также при использовании пыльцевого родителя, зерновки которого перед посевом были обработаны химическими мутагенами — нитрозоме- тилмочевиной и этиленимином. Механизм влияния химических мутагенов (через пыльцу) на возрастание частоты гаплоидии, видимо, аналогичен механизму действия физических мутагенов.

Значимый прорыв в получении гаплоидов произошел с развитием биотехнологии, когда были изучены методы культивирования клеток и тканей на искусственных питательных средах. Впервые в 1949 г. были разработаны экспериментальные методы получения гаплоидов in vitro. Культура мужского и женского гаметофитов — одно из перспективных направлений массового получения гаплоидных растений. Регенерация растений из изолированных пыльников, микроспор и завязей основана на принципе, что гаплоидные клетки гаметофитов имеют широкую компетентность и могут менять свой путь развития с гаметофитного на спорофитный.

Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей растений in vitro:

  • 1) андрогенез — получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор;
  • 2) гиногенез — получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;
  • 3) партеногенез — получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Культура изолированных пыльников и микроспор — один из самых интересных разделов современной биотехнологии. Впервые гаплоидные растения были получены S. Guha, S. С. Maheshwari в 1964 г. для Datura inoxia путем андрогенеза. Затем Nitsch J. Р. получил гаплоидные растения из пыльцевых эмбрио- идов Nicotiana tabacum и Nicotiana silvestris. Эти разработки положили начало развитию нового метода получения гаплоидных растений в культуре пыльников и микроспор. Таким образом, была выявлена тотипотентность незрелой пыльцы, и с этого момента в результате различных исследований стали обнаруживаться возможности спорофитного пути развития в культуре изолированных пыльников у многих видов растений.

В настоящее время исследования по получению гаплоидов методом культуры пыльников проводятся во многих странах мира. Андрогенез отмечен для 240 видов, включая некоторые гибриды, принадлежащие почти к 85 родам и 38 семействам однодольных и двудольных растений.

В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый — образование растений путем прямого эмбриогенеза из изолированных микроспор. При этом внутри пыльников из отдельных незрелых пыльцевых зерен возникают эмбриоиды (рис. 4.7). Они прорастают и формируют гаплоидные растения. Второй — образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. В настоящее время до конца не выявлено, образуются ли они от полиплоидизиро- ванных гаплоидных клеток или от слившихся клеток[1].

Метод культивировании in vitro неоплодотворенных завязей и семяпочек (гиногенез) успешно был применен для ячменя, кукурузы, риса, табака и других сельскохозяйственных культур.

Прямая регенерация соматических эмбриоидов на изолированных пыльниках

Рис. 4.7. Прямая регенерация соматических эмбриоидов на изолированных пыльниках

рапса (Май Дык Чунг, 2010):

  • 1 — глобулярная стадия; 2 — сердцевидная стадия;
  • 3-стадия Торпедо; 4 — проросток

Применение метода культивирования неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro в селекции растений вызвано большей частью тем, что вероятность регенерации при этом зеленых гаплоидных растений составляет 100 % по сравнению с методом культивирования пыльников. Тем не менее некоторые исследователи приходят к выводу, что для отдельных видов, особенно злаковых культур, гиногенез in vitro более перспективен, чем андрогенез in vitro. Установлено, что женские гаметофиты дольше сохраняют способность к новообразованиям, чем мужские. Например, для риса и табака было показано, что культивирование молодых одно-, двух- и четырехядерных зародышевых мешков наиболее эффективно, а для ячменя лучшие результаты были получены при культивировании зрелых зародышевых мешков. Кроме того, исследования показали, что гиногенез является единственным эффективным способом получения гаплоидных растений для Beta vulgaris, Gerbera jamesonii, для которых других способов получения гаплоидных растений не существует. Полученные таким образом гаплоидные растения отличаются высоким потенциалом размножения благодаря экономии времени за счет уменьшения длительности цикла классической селекции и генетической ценности гомозиготных линий. Кроме того, наличие только одного набора хромосом позволяет выявлять мутации, контролируемые рецессивными генами, и восстанавливать уникальные рекомбинанты.

Работы, проведенные на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева, показали, что при культивировании семяпочек на разных вариантах питательных сред отмечалось либо образование каллусной ткани, либо формирование эмбриоидов. Эти процессы зависели от гормонального состава питательной среды. Так, присутствие кинетина в концентрации 1 мг/л в сочетании с 2,4-Д 1 мг/л приводило к формированию каллусной ткани из всех клеток семяпочек, а на среде с Дропп 1,0 мг/л и ИУК 0,5 мг/л — эмбриоидов.

Метод партеногенеза основан на том, что после отдаленного скрещивания хромосомы одного из родителей (гаплопродюсера) могут подвергаться элиминации, в результате чего в яйцеклетке сохраняется только одинарный, гаплоидный набор хромосом. При этом яйцеклетка продолжает развиваться до образования зародыша. Однако такой зародыш для дальнейшего роста и развития нуждается в питательных веществах, поскольку при отдаленной гибридизации, как правило, формирование эндосперма не происходит. Для сохранения такого гаплоидного зародыша его изолируют и в дальнейшем культивируют in vitro на питательных средах определенного состава. Гаплопродюсерами могут выступать как представители одного рода, как, например, ячмень луковичный (Hordeum bulbozum) для ячменя культурного (Hordeum vulgare), так и различных родов — африканское просо (Pennisetum glaucum) и кукуруза (Zea mays) для мягкой пшеницы (Triticum aestivum). Универсальным гаплопродюсе- ром для некоторых зерновых культур — твердой пшеницы, ячменя и овса — является кукуруза.

Метод партеногенеза был применен Као и Kasha в 1969 г. на ячмене при скрещивании Я. vulgare х Я. bulbosum. Использование в качестве га- плопродюсеров кукурузы изучали М. Инагаки, а также К. Суенага и соавторы (1995), американского проса — Ф. Матзк и А. Махн (1994), сорго — Н. Сан, С. Лу и К. Лиу (1996). При этом многие авторы подтверждают максимальный выход гаплоидов мягкой пшеницы при использовании в качестве гаплопродюсера кукурузы.

Таким образом, можно заключить, что для создания гаплоидных растений возможно применять различные методы, которые необходимо выбирать с учетом генетических и физиологических особенностей растений.

  • [1] Калашникова Е. А. Клеточная инженерия растений : учеб, пособие. М. : Изд-во РГАУ-МСХА, 2012.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >