Полная версия

Главная arrow Прочие arrow Биология: генетика. Практический курс

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Цитогенетический метод генетики человека

Цель:

  • 1) выявить генетическое значение и технические особенности метода;
  • 2) сформировать умения по идентификации хромосом человека, дифференциации мужского и женского кариотипов;
  • 3) сформировать умения выявления нарушений кариотипа на хромосомном и геномном уровнях его организации;
  • 4) выявить причины наиболее распространенных наследственных (хромосомных) заболеваний, описать их клинику, меры профилактики и способы лечения;

5) разработать методические рекомендации по организации учебного процесса при изучении этой темы в системе среднего образования.

Контрольные вопросы:

  • 1. Материальные носители генетической программы на разных уровнях организации целостной системы «человек».
  • 2. Кариотип, идиограмма. Систематизации хромосом согласно критериям Денверской и Парижской международных конференций.
  • 3. Аутосомы, половые хромосомы (характеристика на морфологическом и генетическом уровнях). Морфологические типы хромосом: метацентрические, субметацентрические, акроцентрические, телоцентрические.
  • 4. Характеристика кариотипа человека, количественный и качественный состав.
  • 6. Первичные и вторичные признаки полового диморфизма.
  • 7. Теории определения пола человека. Зависимость соотношения пола человека от внешних факторов.
  • 8. Наследственные заболевания, хромосомные болезни, генные болезни (определения).
  • 9. Причины возникновения наследственных заболеваний человека.

Практическая работа 1 Анализ кариотипа здорового человека

Объект исследования: фотокариограммы здоровых людей.

Пояснение к заданию

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа человека. Объектом исследования является любая пролиферативно-активная ткань: клетки костного мозга, фибробласты кожи, лейкоциты периферической крови (лимфоциты), клетки эпителия щеки, клетки, полученные при амниоцентезе и биопсии хориона, клетки абортусов и мертворожденных.

С помощью этого метода был установлен количественный и качественный состав кариотипа человека. Начало истории цитогенетических исследований датируется 1882 г., когда Флемминг, изучая митозы в клетках роговицы, обнаружил 22—28 хроматиновых тел. С этого времени начинается длительный период тонких кариологических исследований, результатом которых были такие данные: кариотип человека представлен 47 хромосомами, при этом женский пол определяется половыми хромосомами XX, мужской —ХО (Винивортер, 1912); кариотип человека представлен 48 хромосомами, при этом женский пол определяется половыми хромосомами XX, мужской — XY (Пэйнтер, 1923). Окончательным заявлением по вопросу количественного состава кариотипа стали сообщения двух шведских ученых Тио и Леван (1956), которые на материале культуры легких трех эмбрионов установили, что диплоидное число хромосом в делящихся соматических клетках постоянно и равно 46. Именно они в то время дали одно из самых полных описаний кариотипа человека, указав морфологическую характеристику его. С 1959 г. начинаются работы по индивидуальной идентификации каждой пары хромосом и развитие цитогенетического метода генетики человека.

Задачи этого метода:

  • 1) описание кариотипа с целью выявления геномных и хромосомных отклонений от нормы,
  • 2) диагностика наследственных заболеваний.

Техника метода:

  • 1) взятие пробы для анализа;
  • 2) культивирование клеток на искусственной питательной среде с добавлением фитогемаглютинина с целью стимуляции митозов;
  • 3) добавление в среду колхицина для разрушения нитей ахромати- нового аппарата, что, в свою очередь, приводит к торможению митозов, накоплению метафазных пластинок;
  • 4) обработка клеток гипотоническим раствором хлорида натрия для лучшего разобщения хромосом, свободного размещения на определенном расстоянии друг от друга;
  • 5) фиксация материала;
  • 6) высушивание взвеси клеток на предметом стекле с последующей окраской. Для сплошного окрашивания используют различные красители: азур, лакмоид, арсеин, фуксин. Дифференцированную окраску осуществляют по Q-, G-, С-технике. Так, например, метод Q предполагает использование флюорохромов, акрихина и других специальных красителей, позволяющих выявить последовательности нуклеотидов в ДНК;
  • 7) изучение под микроскопом и фотографирование;
  • 8) вырезание отдельных хромосом фотокариограммы, описание морфологии с расчетом центромерного индекса, составление идио- граммы.

Изучение фотокариограмм позволяет установить количественный и качественный состав индивидуального хромосомного набора пробанда (обратившегося за консультацией в медико-генетическую консультацию) и членов его семьи.

Техника анализа фотокариограмм

  • 1. Приготовьте на чистой странице тетради или альбома заготовку для работы, для этого согласно стандартной идиограмме нормального кариотипа (рис. VI.1) напишите в 4 ряда порядковые номера с 1 по 22.
  • 2. С помощью глазных ножниц разрежьте фотокариограмму (хромосомы в метафазу или метафазная пластинка кариотипа) на несколько фрагментов так, чтобы не повредить структуры хромосом.
  • 3. Сосчитайте число хромосом на каждом фрагмента, тем самым установите количественный состав индивидуального кариотипа. Запишите это число в тетради и сразу определите, есть ли нарушения количественного состава.
  • 4. Вырезайте каждую хромосому отдельно, раскладывая на белом листе бумаги, по мере вырезания идентифицируйте хромосомы согласно размерам и форме, составляя гомологичные пары. Если кари- ограммы с дифференцированной окраской хромосом, то сразу сопоставляйте и характер чередования эу- и гетерохроматиновых районов. Для более точной идентификации хромосом по дифференцированной окраске пользуйтесь ручной лупой.
  • 5. Поместите подобранные пары хромосом на заготовленный лист тетради, сопоставляя со стандартной идиограммой здорового человека и характеристикой, представленной в таблице VI.4, начиная с самой крупной по размеру пары.
  • 6. Установите количественный состав хромосом группы С, тем самым определите пол пробанда. Если число хромосом этой группы равно 16, то это женский кариотип, если 15, то мужской, тогда найдите У-хромосому.
  • 7. Приклейте хромосомы в тетрадь, обратите внимание на структуру каждой пары, тем самым проведите анализ на наличие хромосомных аберраций.
  • 8. Опишите каждую пару хромосом с помощью таблицы.
  • 9. Сделайте вывод, укажите нормальный это кариотип или с патологией, женский или мужской. В случае если обнаружена патология на хромосомном или геномном уровне, определите ее с помощью справочника наследственных заболеваний.

Методическая часть

Программно-методические материалы и программы по биологии разных авторов предусматривают и на предпрофильной (среднее, основное общее), и на профильной (среднее, полное общее) ступенях образования формирование знаний генетики для профилактики наследственных заболеваний с характеристикой методов изучения наследственности человека, аномалий кариотипа и диагностики болезней. В связи с этим программы предусматривают демонстрацию карт хромосом человека.

Сложность понятийного аппарата генетики как раздела предмета «Общая биология», практическая значимость и одновременно дефицит времени, отведенного на изучение этого раздела, диктует необходимость рационального использования методов и средств обучения. Так, целесообразно изучение генетики человека организовывать на протяжении всего раздела, начиная с тем по цитогенетике, т. е. с момента формирования таких понятий, как «хромосома», «кариотип» (раздел «Учение о клетке»). Формирование этих понятий можно проводить с помощью таких средств изучения, как фотокариограммы человека и таких методов, как лабораторная работа «Изучение кариотипа человека». Такое учебное занятие обеспечит более эффективное восприятия материала по генетике человека.

Задание

1. Составить кариограмму индивидуального фотокариотипа и установить количественный и качественный состав его.

  • 2. Описать хромосомы кариотипа человека с помощью таблицы.
  • 3. Разработать методические рекомендации по организации и проведению лабораторной работы «Изучение кариотипа человека».

Оборудование: фотокариограммы здоровых людей (мужчины и женщины; приложение 5а, 56), ножницы, пинцет, клей, кювет для мусора, ручная лупа.

Практическая работа 2

Анализ кариотипа больных с наследственно-обусловленной

патологий

Объект исследования: фотокариограммы больных людей.

Пояснение к заданию

Усовершенствование цитогенетического метода генетики человека в дальнейшем позволило использовать его для определения нарушений кариотипа на хромосомном и геномном уровнях, а также для изучения многих типов врожденных аномалий, и прежде всего наследственных патологий.

Так, уже в 1959 г. французский исследователь Лежен открыл три- сомию по 21 паре аутосом, что являлось причиной описанного ранее в 1866 г. синдрома Дауна. В этом же году Джекобе и Стронг обнаружили лишнюю Х-хромосому при синдроме Клайнфельтера, а также нехватку X половой хромосомы при синдроме Тернера-Шерешёвского, что также стало причиной этих патологий. В 1960 г. Патау с сотрудниками и Эдварс с сотрудниками описали две аутосомные аномалии, идентифицированные как трисомии 13 и 18 пар. В 1963 г. Нежен с сотрудниками установил, что причиной синдрома «кошачий крик» является хромосомная аберрация 5-й пары аутосом по типу делеции.

С этого время датируется появление такой отрасли генетики человека, как клиническая цитогенетика человека. Основным методом этой отрасли является цитогенетический метод, который нашел широкое применение в одной из наиболее перспективных диагностик наследственных заболеваний в настоящее время, это пренатальная диагностика.

Завершающей операцией цитогенетического метода является кари- отипирование и анализ фотокариограммы. Техника кариотипирова- ния приведена в предыдущей практической работе. Выполняя данную работу, необходимо особое внимание обратить на количественный состав кариотипа и схожесть гомологичных пар. В выводе следует указать тип нарушений, следствие этого нарушения, т. е. название заболевания, привести клинику его, перечислить возможные способы лечения этого заболевания и меры его профилактики.

Методическая часть

Как уже отмечалось в методической части предыдущей практической работы, программно-методические материалы и программы по биологии разных авторов предусматривают на обеих ступенях образования формирование знаний генетики для профилактики наследственных заболеваний с характеристикой аномалий кариотипа. В связи с этим программы рекомендуют демонстрацию фотокариограмм больных людей, а также фенотипическое проявление некоторых заболеваний. Согласно содержательному компоненту учебников под редакцией Захарова, Рувинского учащиеся обязательно должны знать патогенез, клинику таких заболеваний, как синдромы Дауна, Патау, Эдварса, Тернера — Шерешевского, Клайнфельтера, трисомии женского типа, кошачьего крика.

Формирование таких сложных по содержанию понятий, как «наследственные заболевания», «хромосомные болезни», «молекулярные болезни», целесообразно организовывать на учебных занятиях (уроках) при изучении темы «Мутационная изменчивость» с последующим обобщением и переводом этих понятий на 3—4 уровни их сформированное™ (практическое применение в стандартных и нестандартных ситуациях). Обобщающий урок на завершающем этапе изучения раздела «Наследственность и изменчивость организмов» даст наибольший эффект при использовании игровой технологии. В данном случае наиболее оптимальным вариантом игры может быть ситуация медикогенетической консультации. Рекомендации по организации такой игры представлены в учебном пособии В. И. Нахаевой (2001).

Задание

  • 1. Составить кариограмму индивидуального фотокариотипа и установить его количественный и качественный состав.
  • 2. Определить заболевание, причиной которого стала зарегистрированная аномалия индивидуального кариотипа, описать клинику, способы лечения, меры профилактики этого заболевания, используя материалы справочника наследственных заболевании.
  • 3. Разработать графологическую схему понятия «наследственные заболевания» с указанием тем уроков, на которых будут формироваться признаки этого понятия.

Оборудование: фотокариограммы больных людей (приложение 5в, 5г, 5д, 5е), справочник наследственных болезней, ножницы, пинцет, клей, кювет для мусора, ручная лупа.

Лабораторная работа Определение полового хроматина

Объект исследования: эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки (буккальный соскоб).

Пояснение к заданию

К дополнительным цитогенетическим методам относится метод определения полового хроматинательца Барра. В 1949 г. Барр и Бертрам, изучая нейроны кошки, обнаружили в интерфазном ядре небольшое дисковидное интенсивно окрашенное тельце (рис. VI.2). Это образование позже было обнаружено в клетках большинства животных, в том числе и человека, и только у особей женского пола. При изучении онтогенеза было установлено, что оно образуется на ранних стадиях гаструлы, т. е. до образования половых гонад. На форму тельца не оказывают влияние гормоны, следовательно, это не признак вторичного полового диморфизма. Прямая связь между числом телец и числом Х-хромосом указывает на его принадлежность к генетическому аппарату на субклеточном уровне.

VI.2. Тельце Барра (половой гетерохроматин) в ядрах клеток слизистой полости рта женщины (микрофотография)

Рис. VI.2. Тельце Барра (половой гетерохроматин) в ядрах клеток слизистой полости рта женщины (микрофотография)

Тельце Барра, половой хроматин — это спирализованная Х-хромо- сома, претерпевшая инактивацию в раннем эмбриогенезе женщины до развития половых желез, с целью выравнивания баланса генов половых хромосом в клетках организмов мужского и женского пола.

Половой хроматин может быть определен в любых тканях, для этого после взятия пробы клетки фиксируют, окрашивают, микроскопируют. В качестве Х-хроматина учитывают самый большой по размеру хромоцентр треугольно-выпуклой формы, прилегающий кядерной мембране.

Количество телец свидетельствует о количестве Х-хромосом в кариотипе как женщины, так и мужчины. Если одно тельце, то количество Х-хромосом у женщины в норме, если более, чем одно, то количество Х-хромосом больше нормы, если нет тельца Барра, то в кариотипе у женщины одна половая Х-хромосома. Этот метод технически прост, в связи с чем получил название экспресс-диагностики.

Задачи этого метода заключаются в следующем:

  • 1) диагностировать наследственные патологии, причиной которых являются геномные мутации;
  • 2) установить половую принадлежности в судебной медицине и при трансплантации тканей донора.

Техника приготовления препарата интерфазного ялра буккалъного эпителия человека:

  • 1. Взятие пробы для анализа.
  • • Предварительно прополощите рот дистиллированной водой, обработайте салфеткой, смоченной 75%-ным спиртом, место, где предполагается сделать соскоб.
  • • Слегка заостренным концом металлического или деревянного, стерильно обработанного 75%-ным спиртом, шпателем скользящим движением перпендикулярно щеке по слизистой сделайте соскоб с внутренней стороны щеки.
  • 2. Приготовление мазка.
  • • Горизонтальным движением конца шпателя перенесите материал (мазок) на центр предметного стекла, предварительно тщательно протертого спиртом.
  • • Нанесите на материал несколько капель фиксатора (3 части ледяной уксусной кислоты и 1 часть 96%-ного этанолового спирта). Время фиксации — 3—5 минут.
  • • На материал нанесите несколько капель 2%-го ацетоорсеина. Накройте препарат крышкой чашки Петри, чтобы меньше шло иссушение. Время окрашивания — 20—30 минут.
  • • После истечения времени окрашивания смойте краситель под струей проточной воды.
  • • Накройте препарат покровным стеклом.
  • 3. Изучение препарата под микроскопом.
  • • При увеличении х40 проведите анализ около 200 клеток нескольких полей зрений, фиксируя клетки с половым хроматином. Учитывайте только тельца, прилежащие к ядерной оболочке, размером около 1 мкм.

Приготовление ацетоорсеина.

1 г орсеина растворить в 45 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор довести до кипения, охладить и профильтровать через несколько слоев фильтровальной бумаги. К полученному раствору добавить 55 частей дистиллированной воды. Произвести повторное кипячение, охлаждение и фильтрацию.

Задание

  • 1. Приготовить 4 препарата каждому студенту, сделав буккальный соскоб в ротовой полости женщины (2 препарата) и мужчины (2 препарата).
  • 2. Провести изучение препаратов и зарисовать тельце Барра.

Оборудование: предметные и покровные стекла, 75%-ный спирт,

ватные стерильные тампоны, фильтровальная бумага (полоски 2 х х 5 см), металлический шпатель, 2%-ный раствор орсеина, микроскоп.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>