Техника генной инженерии

А. Получение генов

Получить нужный ген можно следующими способами:

  • • выделение из ДНК;
  • • воссоздание ферментативным синтезом на основе изолированной матричной мРНК с помощью РНК-зависимой ДНК- полимеразы (ревертазы).

Выделение генов из ДНК. Изолированную ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют упомянутые выше ферменты рестриктазы.

При этом образуются фрагменты с тупыми или липкими концами. При необходимости тупые концы превращают в липкие, присоединяя двухцепочечные последовательности (линкеры) с участками узнавания рестриктазы, дающей липкие концы. Нуклеотидная последовательность с липкими концами может быть:

  • а) присоединена к вектору, обработанному той же рестрик- тазой;
  • б) превращена из линейной молекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплиментарных концов.

Этот метод имеет недостатки:

  • 1) трудность подобрать рестриктазы, для выделения именно нужного участка ДНК;
  • 2) полученные фрагменты, наряду с нужной структурой содержат лишние нуклеотидные последовательности, создающие помехи. Кроме того, рестриктаза может отцепить нужную нуклеотидную последовательность, из-за чего ген теряет полноценность. Гены эукариотов имеют сложное строение. Они имеют функциональные участки, синтезирующие белок (экзоны) и незначащие участки (интроны). Зрелая матричная РНК включает только экзоны. Однако трансплантированные гены имеют зоны обоих типов, и это является затруднением для их работы.

После обработки рестриктазами очень трудно бывает выделить из полученной смеси нужные фрагменты.

Химико-ферментативный синтез генов. Метод включает химический синтез коротких одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов.

Это позволяет избежать липких последовательностей в ДНК, а также получать разнообразные участки узнавания, регуляторные последовательности и т. д.

Применимость метода ограничена недостатком информации о нуклеотидной последовательности генов. Такая последовательность воссоздается на основе знания о цепочке аминокислотных остатков в кодируемом белке.

Ферментативный синтез генов на основе выделенной клетки матричной ДНК. Метод применяется для переноса информации, которую несет ДНК клетки растения, животного или человека в клетку микроорганизма-продуцента. В этом случае исходная ДНК принимается за матричную (мДНК).

Фермент обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, которая комплементарна мДНК. Полученную одноцепочечную ДНК называют комплементарной ДНК (кДНК). Ее используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с помощью ДНК-полимеразы или ревертазы.

В этом методе получаемый ген не содержит лишних участков (интронов).

Создать условия для аккумуляции клеткой нужного гена легче, чем отбирать ген из смеси фрагментов.

Так был создан гормон роста человека — соматотропин.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >