Полная версия

Главная arrow Агропромышленность arrow СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Б. Введение гена в вектор

Сам по себе полученный ген не может синтезировать белок. Синтез осуществляется в клетке с помощью рекомбинантной ДНК. Ген переносится в клетку в составе вектора. Чаще всего в качестве вектора служит кольцевая молекула, способная к самостоятельной репликации. Такая ДНК называется плазмидой.

Конструирование рек-ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой с образованием липких концов. Они комплементарны вводимой ДНК.

Комплементарные участки вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и вновь получают кольцевую молекулу.

Векторами могут служить как плазмиды, так и вирусы (фаги). У некоторых фагов значительная часть ДНК не нужна для размножения в клетке. Выделив ДНК фага и расщепив ее в области несущественного участка, можно с помощью лигазы в место разрыва вставить чужеродную ДНК (или ее фрагмент). Но используемые вирусы должны иметь ослабленную патогенность, чтобы клетки выживали и сохраняли информацию. Это свойство называется аттеньюацией.

Вирусы быстро передаются из клетки в клетку. Появляется возможность лечения наследственных заболеваний введением вирусов во все клетки тела.

Кольцевые генетические самореплицирующиеся единицы найдены у грибов, бактерий, некоторых растений и животных.

Они могут быть конъюгативными и неконъюгативными.

При конструировании вектора в него вводят участки узнавания рестриктаз и гены-маркеры, кодирующие нужные признаки организма.

Разновидностью плазмид являются космиды. Так называются плазмиды, в которые введены участки, отвечающие за упаковку ДНК в фаговую частицу. Космиды обладают очень большим объемом информации. Они содержат cos-участок ДНК фага Е. coli, отвечающие за упаковку.

Перспективны плазмиды м.о. бактерий Risobium и Agrobacterium. Они содержат опухолеродные Ti-плазмиды содержащие по три ростовых гена. Эти гены вызывают образование опухолей. Онкоген убирают, а взамен вводят полезный вектор (синтез производных аргинина).

В. Перенос генов в клетки-реципиенты

Передача встроенных генов осуществляется путем трансформации и конъюгации.

При трансформации происходит перенос свободной ДНК в реципиентную клетку. При этом происходит рекомбинация и интегрирование одноветьевого фрагмента ДНК в генетическую единицу.

Для проникновения ДНК в клетку она должна быть компетентной. Выделены и очищены факторы компетентности — особые белки.

Генетический материал, попавший в клетку, может быть остановлен нуклеазами. Для успешной трансформации необходимо подавить активность либо синтез нуклеаз. Второй путь — включение трансформирующей ДНК в липосомы (искусственные мембраны).

Трансформация — универсальный путь передачи информации.

Конъюгация и трансфекция по существу являются вариантами трансформации. Конъюгация осложнена необходимостью приспособлений для переноса генов. Методом конъюгации переносятся лишь некоторые (конъюгативные) плазмиды.

При трансфекции в клетке развиваются вирусные частицы. Методика осуществления трансфекции для бактерий включает:

  • • получение сферопластов,
  • • очистку среды инкубации от внеклеточных нуклеаз,
  • • добавление очищенной ДНК того или иного фага вместе с протамина сульфатом для повышения эффективности трансфекции.

Для стабилизации сферопластов добавляют спермин и другие полиамины.

Трансфекция может быть осуществлена как в виде использования очищенной ДНК и протопластов, так и в виде заражения целых многоклеточных организмов вирусными частицами либо их ДНК.

Сконструированы челночные векторы, которые способны к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживают клонируемого гена в живой клетке.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>