Подвижные генетические элементы эукариот

Существенную часть генома эукариот (10—30 %) составляют повторяющиеся последовательности, имеющие определенную структурную организацию и способные перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они получили название подвижных генетических элементов. Элементы включают в свой состав от тысячи до десятков тысяч нуклеотидных пар. Перемещение подвижных элементов осуществляется либо путем вырезания элемента из одного места и встраивания его в другое, либо путем образования копии подвижного элемента, внедряющейся в новое место, тогда как родительская копия остается на прежнем месте. В последнем случае увеличивается их число в геноме. Открытие подвижных элементов показало, что последовательность нуклеотидов ДНК по длине хромосомы изменяется благодаря перемещению этих элементов. Встраиваясь в гены или в соседние с генами области, они либо вызывают мутации, либо повышают уровень активности близлежащих генов. Все это позволило взглянуть по-новому на природу мутационных процессов и молекулярных механизмов эволюции генома.

Подвижные элементы эукариот представлены отдельными семействами, сходными по своей структуре и поведению. Внутри семейства различаются подсемейства идентичных или очень сходных подвижных элементов, число которых колеблется от нескольких копий до нескольких тысяч копий на геном. Наибольшее количество подвижных элементов обнаружено в геноме растений (до 50 %). Подвижные генетические элементы обычно рассеяны по геному, но могут концентрироваться в отдельных участках хромосом.

Различают два основных класса подвижных генетических элементов: транспозоны и ретротранспозоны. Такая классификация основана на молекулярных механизмах, с помощью которых перемещаются эти элементы.

Транспозоны. Эти элементы ограничены инвертированными повторами (последовательностями, направленными навстречу друг другу) — как и некоторые транспозоны прокариот (см. п. 5.4). Примерами их могут служить P-элемент дрозофилы и Ас-элемент кукурузы. В геномах этих организмов насчитывается по 30 — 50 копий таких элементов. Полные копии (часть копий дефектна, так как имеет внутренние делении) содержат открытые рамки считывания, кодирующие транспозазу (рис. 6.16).

Рис. 6.16. Транспозоны эукариот

Схема перемещения транспозона показана на рис. 6.17. Инвертированные повторы необходимы для перемещения элемента, которое осуществляется благодаря их сближению друг с другом и узнаванию транспозазами. Инвертированные повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина. Вырезанный транс- позон внедряется в район вносимого транспозазой разрыва в молекуле-мишени и сшивается с ДНК хозяина в новом месте. Разрыв и зашивание осуществляются транспозазой и вспомогательными белками. Транспозаза может кодироваться как самим подвижным элементом, который будет перемещаться, так и другой копией элемента, локализованной в том же геноме в отдалении. Р-элементы обычно встраиваются в определенные сайты, консенсусная последовательность которых такова: 5'-GGCCAGAC. При встраивании P-элемента этот сайт-мишень дуплицируется.

Рис. 6.17. Перемещение транспозона

P-элемент содержится только в некоторых линиях D. melanogaster. Скрещивание самок без P-элемента с самцами, несущими Р-элементы. приводит у гибридов к транспозициям P-элемента, которые наблюдаются только в клетках зародышевого пути. Совокупность наблюдаемых эффектов называют гибридным дисгенезом. Дисгенные мухи часто оказываются стерильными, а если они фертильны, то у их потомков обнаруживается множество мутаций и эти признаки передаются следующим поколениям. Поэтому линии с P-элементом и без него выглядят как репродуктивно изолированные, по крайней мере частично. Биологическая изоляция играет огромную роль в процессе эволюции. Изоляция линий вызвана активацией транспозиций P-элемента, присутствующего в одной из них. Причина, почему транспозиции P-элемента ограничены зародышевыми клетками, состоит в том, что только в клетках-предшественниках гамет осуществляется такой тип сплайсинга, который приводит к образованию непрерывной открытой рамки трансляции, кодирующей транспозазу (см. рис. 6.16). Ограничение транспозиции зародышевыми клетками имеет определенный смысл, поскольку обеспечивает выживание особей, несущих гаметы, в которых произошли геномные перестройки вследствие транспозиции P-элемента. Подобный «геномный шок», сопровождающийся высокой частотой мутагенеза, может обеспечить большую степень геномной изменчивости, которая послужит материалом для отбора в процессе эволюции.

Перемещения Ас-элемента происходят и в соматических клетках кукурузы. За ними можно следить по распределению мутантных участков ткани, например лишенных пигмента вследствие инактивации гена, определяющего пигментацию. Потомство клетки, содержащей только инактивированные гены, также будет лишено пигмента. Вырезание мобильного элемента приводит к реактивации гена. В связи с этим был сделан вывод о регуляторной функции перемещающихся элементов, и они были названы контролирующими (Б. Мак-Клинток).

Брешь в ДНК после вырезания транспозона может заделываться либо с помощью гомологичного отрезка ДНК, либо за счет сшивания разорванных концов (это особенно характерно для транспозо- нов растений).

В целом подвижные элементы эукариот представляют собой чрезвычайно разнородную популяцию. Существует мнение о том, что они не влияют на фенотип организма и размножаются в геноме лишь благодаря особенностям своей структуры, в результате чего постепенно заселяют геном. Предполагается, что они составляют часть так называемой эгоистичной ДНК, размножение которой ограничивается естественным отбором. Отбор устраняет те случаи, когда внедрение эгоистичной ДНК сопровождается вредными последствиями. На определенных стадиях эволюции эти элементы могут использоваться для целей, которые в дальнейшем обеспечат селективные преимущества организму.

Большой класс подвижных элементов представляют ретротран- спозоны, сходные по своей структуре с проретровирусами, которые внедряются в геном, используя механизмы обратной транскрипции (см. п. 7.4). Эти элементы содержат «тело» размером 5—8 тыс. н. п., ограниченное прямыми длинными концевыми повторами (ДКП, или LTR — от англ, long terminal repeats), обычно содержащими по 300—400 н. п. (рис. 6.18). Число копий этих элементов, принадлежащих к одному семейству, достаточно постоянно для вида, но варьирует от нескольких копий до сотен тысяч копий в зависимости от типа ретротранспозона. Ретротранспозоны, относящиеся к разным семействам, не имеют протяженных гомологий нуклеотидных последовательностей ни в ДКП, ни в теле. В составе «тела» элемента обнаруживаются открытые рамки считывания для обратной транскриптазы и нуклеазы (интегразы). Разные копии одного семейства могут иметь вставки и делеции как в ДКП, так и в самом элементе. По флангам ДКП находятся короткие прямые повторы. Ретротранспозоны широко распространены у эукариот.

Один из способов перемещения ретротранспозонов предполагает его транскрипцию с помощью РНК-полимеразы II. В составе ДКП имеются сайты инициации транскрипции и сигналы полиаденилиро- вания. ДКП могут служить активными промоторами. Транскрипция начинается в одном ДКП (условно левом, 5'-ДКП), а заканчивается в другом (правом, З'-ДКП). Синтезируемая молекула РНК транслируется с образованием ферментов, необходимых для синтеза ДНК и внедрения ее в геном. Эта схема полностью повторяет схему образования и интеграции провируса (рис. 6.19). Остается открытым вопрос: произошли ли ретровирусы из ретротранспозонов или, напротив, ретро- транспозоны возникли из вирусов в результате потери способности к заражению? Подавляющая часть ретротранспозонов (при сравнении их с ретровирусами) либо потеряла ген оболочки вируса, либо еще не приобрела его. Таким образом, ретротранспозоны представляют собой внутригеномные, неинфекционные элементы, способные лишь к самовоспроизведению и «подзаражению» того же генома.

Рис. 6.18. Структура ретротранспозона с длинным концевым повтором

Внедрение ретротранспозона внутрь гена или около гена вызывает разные эффекты. Во многих случаях происходит инактивация гена (рис. 6.20). При интеграции в район промотора на 5'-фланге гена ре- тротранспозон может резко активировать экспрессию гена, обеспечивая транскрипцию с собственного промотора. Если в этом случае подвижный элемент оказался около протоонкогена, то результатом может быть сверхпродукиия белка и злокачественное перерождение клетки. Это же возможно при воздействии энхансеров, привносимых мобильным элементом. Особые возможности для перенесения и приобретения регуляторных сигналов возникают тогда, когда элемент (ретротранспозон) удаляется за счет гомологичной комбинации между ДКП с идентичными повторами (см. рис. 6.20). В результате сохраняется лишь один ДКП на месте внедрения ретротранспозона. В свою очередь одинокие ДКП существенно влияют на изменчивость регуляторных систем клетки. Именно такой промотор может перепрограммировать характер зависимости работы гена как от внешних сигналов, так и от внутриклеточных регуляторных систем.

Рис. 6.19. Перемещение ретротранспозона с длинным концевым повтором

Рис. 6.20. Эффекты внедрения ретротранспозона внутрь гена или около гена:

а — нарушение транскрипции при внедрении в интрон; б — усиление экспрессии гена при внедрении в 5'-район гена

Представленные случаи внедрения элемента сопровождаются мутациями с самыми разными фенотипическими проявлениями, обусловленными подавлением образования или, наоборот, гиперпродукцией белка. Перемещение элементов по геному способствует распространению регуляторных сигналов (сайтов инициации транскрипции, сигналов полиаденилирования, или энхансеров), что делает значительной роль мобильных элементов в эволюции систем регуляции.

Существует другой большой класс ретротранспозонов, которые не несут длинных концевых повторов. Механизм внедрения их несколько иной, хотя он также осуществляется с помощью обратной транскрипции. К ним относятся представители семейства L1, населяющие геном человека. Репликация элемента без ДКП сопряжена непосредственно с районом будущего внедрения ретротранспозона (рис. 6.21). РНК, образовавшаяся при транскрипции элемента, перемещается к достаточно случайному месту разрыва ДНК-мишени, часто сшивается с одной из нитей ДНК. Сюда устремляются и необходимые для интеграции белки — обратная транскриптаза и инте- граза. Другая, комплементарная нить ДНК служит затравкой для копирования РНК-копии элемента с участием обратной транскриптазы. Фермент копирует сначала небольшой участок ДНК-мишени, а затем меняет матрицу и копирует РНК, после чего РНК удаляется и образуется вторая комплементарная нить ДНК. Ретротранспозоны без ДКП участвуют в сохранении концов хромосом в ряду поколений.

Рис. 6.21. Перемещение ретротранспозона без ДКП

Подобную функцию у многих организмов выполняет теломераза. У ряда насекомых, в том числе и у дрозофилы, отсутствует теломе- разная активность. Концы ДНК у них удлиняются за счет перемещений ретротранспозонов и в этом случае выступают как компоненты генома, спасающие хромосому от укорачивания. Ретротранспозоны перемещаются, образуя повторяющуюся структуру, в которой элементы соединены друг с другом по типу «голова к хвосту». Сначала на РНК-транскрипте как на матрице с помощью обратной транскрипции строится комплементарная нить ДНК, а затем после удаления РНК-матрицы достраивается другая. Таким образом, геном хозяина приспособил эти элементы для сохранения концевых участков хромосом, для спасения хромосомы от потери генов.

В геноме млекопитающих, птиц, амфибий и насекомых обнаруживаются ретропозоны — внедрившиеся в геном ДНК-копии, синтезированные на разных типах клеточных РНК, как на матрицах. Структура ретропозонов позволяет с уверенностью говорить об участии обратной транскрипции в процессе их образования. Таким образом, наряду с переносом информации от ДНК к РНК осуществляется и обратный процесс — возвращение ее в геном в виде ретропозонов. У млекопитающих ретропозоны составляют более 10 % ДНК, следовательно, мощность встречного потока информации от РНК к ДНК может быть существенной, по крайней мере при оценке его во временном эволюционном масштабе. Различают разные типы ретропозонов, среди них псевдогены. Это копии генов, лишенные интронов и обладающие последовательностью поли-дА- поли-дТ на З'-фланге. Матрицей при их копировании послужила «процессированная» полиаденилированная мРНК. Рамки трансляции таких «генов» часто «испорчены» стоп-кодонами и делециями. Они, как и проретровирусы, ограничены короткими прямыми повторами, представляющими собой дупликацию геномной последовательности в области сайта внедрения ДНК-копии, образованной на мРНК. Если ретропозон правильно процессирован, ДНК-копия содержит открытую рамку считывания и возможна его экспрессия, то такие ретропозоны называют ретрогенами.

Большую массу повторяющихся элементов позвоночных представляют ДНК-копии клеточных РНК, кодирующих белки неизвестной природы, а также аномально процессированных клеточных транскриптов тРНК, 7S РНК и UPHK. Они представляют собой длинные и короткие повторы. Семейства повторяющихся последовательностей часто получают свои названия по расщепляющим их рестриктазам (например, короткие Alu-повторы или длинные Крп-повторы в геноме человека).

Каждый вид млекопитающих обладает собственным главным семейством длинных повторов, отличающих его от других видов. Предполагают, что разные семейства длинных повторов возникли сравнительно недавно, уже после эволюционной дивергенции видов млекопитающих.

Короткие повторы, например повторы Alu-семейства у человека, составляют 3-10⁵, что соответствует 5—6 % массы ДНК клетки. Их нуклеотидная последовательность гомологична последовательности отдельных участков 7S РНК. Такие повторы рассеяны по геному, их обнаруживают в интронах, на 5'-флангах генов, в составе З'-нетранслируемых участков гена.

Между особями одного вида иногда наблюдаются различия (полиморфизм) в структуре генов и их ближайшего окружения, обусловленные внедрением коротких или длинных повторов. В геноме существует множество неактивных дефектных копий этих элементов, они не способны кодировать транспозазу или обратную транскриптазу. С другой стороны, они сохраняют способность к перемещениям, если в случае транспозонов имеются инвертированные повторы, узнаваемые транспозазой, а в случае ретротранспозонов сохранены промотор и возможность транскрипции элемента. Множество таких дефектных копий начнут перемещаться, если ферменты, ответственные за перемещение, будут кодироваться другими полноценными элементами. В геноме человека источником активной обратной транскриптазы является ретротранспозон L1, число копий которого достигает 100 тыс. Из них активно перемещаются 30—60 тыс., остальные, поврежденные, перемещаться не могут.

Мобильные генетические элементы могут принимать участие в перестройках хромосом. Наличие в хромосомах нескольких одинаковых по нуклеотидной последовательности копий подвижного элемента позволяет в редких случаях осуществить рекомбинацию по районам их локализации. В результате неравного кроссингове- ра возникают делеции отдельных участков или, наоборот, дупликации (рис. 6.22). Неравный кроссинговер по районам локализации транспозона mariner (моряк) у человека приводит к делеции участка в коротком плече 17-й хромосомы. Если это событие происходит в зародышевой клетке при созревании гамет, то хромосома с деле- цией будет передана потомкам. Это приводит к наследственным заболеваниям нервной системы — невропатиям и параличам. Вну- трихромосомная рекомбинация между двумя элементами приводит к инверсии — повороту участка хромосомы на 180°. Инверсия может быть вредна для организма, а может способствовать эволюции генома, поскольку помогает передать потомству случайно сложившееся благоприятное сочетание генов, препятствуя кроссинговеру.

Ретротранспозоны с ДКП участвуют в ликвидации двунитевых разрывов ДНК. Обычно такой разрыв залечивается с помощью гомологичной молекулы ДНК, например сестринской, только что реплицированной нити. Участие реплицирующейся ДНК ретротранспозонов с ДКП в процессе заживления двунитевых разрывов обнаружено у дрожжей (рис. 6.23). Брешь в двунитевой спирали, заделанная ретротранспозоном, сохраняет целостность хромосомы, но изменяет ее нуклеотидную последовательность. Если район хромосомы. где была брешь, не содержит существенного гена, то клетка остается жизнеспособной.

Рис. 6.22. Перестройки хромосом, обусловленные присутствием в них одинаковых повторяющихся последовательностей (обозначены буквами), представленных подвижными элементами

Рис. 6.23. Устранение двунитевого разрыва ДНК с помощью ретротранспозона

Подвижные элементы не стоит рассматривать только как «эгоистическую» ДНК, паразитирующую на ДНК клетки-хозяина. Они приспособлены и для нужд генома клетки: способствуют сохранению структурной целостности хромосомной ДНК; внедряясь в гены, не только инактивируют, вызывая мутации, но и меняют характер их экспрессии. В связи с этим подвижные генетические элементы, будучи важными факторами изменчивости генов и участвуя в перестройках структуры хромосом, имеют огромное значение в процессах эволюции геномов.