Гидратация и взаимодействие пищевых биополимеров в водной фазе

Молекула белка в растворе

Упрощенно связывание воды белками можно представить следующим образом:

Рассмотрим адсорбции воды белком на примере пептида гли-цин-аланина. В водных растворах белков их молекулы образуют внутреннюю соль (т. е. от карбоксильной группы СООН отрывается протон и присоединяется к аммонийной группе МН2). Обе эти группы ионизируются. Если среда кислая, т. е. имеется избыток ионов Н+ над ионами ОН-, то часть протонов Н+ присоединяется к отрицательно заряженным карбоксильным группам, нейтрализуя их:

Ионизированные группы Ь1Н? окружаются диполями воды, т. е. имеет место ионная адсорбция влаги белком. Если среда щелочная, то нейтрализуется аммонийная группа ИЩ, а к отрицательно заряженной карбоксильной группе притягиваются диполи воды. Вода может связываться незаряженной пептидной группой -СО-ИН-благодаря большей электронной плотности в области атомов N и О по сравнению с атомами Н и С. Однако эта связь (молекулярная) значительно слабее ионной.

При pH среды, соответствующем изоэлектрической точке данного белка, молекула белка становится электрически нейтральной.

В этом случае ионная адсорбция исключена, и остается лишь механизм молекулярной адсорбции, поэтому гидратация молекулы минимальна. На поверхности гидратационного слоя или слоя моно-молекулярной адсорбции происходит полимолекулярная адсорбция, т. е. образуется еще несколько слоев молекул воды. Влага полимоле-кулярной адсорбции составляет основную долю воды, содержащейся в мышечной ткани.

Вода является существенным элементом, во многом определяющим структуру белковой молекулы, ее функциональные свойства, способность к агрегации с другими молекулами.

Особенности гидратации молекулы белка тесно связаны с ее строением. Молекула белка представляет собой свернутую определенным образом цепь из пептидных мостиков, к которым присоединены боковые аминокислотные остатки.

Пептидная связь в белках представлена двумя основными структурами — структурой 1 (60 %) и структурой 2 (40 %) (рис. 4.1).

Пептидная связь структур 1 и 2 (И — боковой аминокислотный остаток)

Рис. 4.1. Пептидная связь структур 1 и 2 (И — боковой аминокислотный остаток)

В структуре 1 связи образованы 5-электронами, в структуре 2 — л-электронами. Вращение вокруг связи N-0 в структуре 2 затруднено, кроме того, в ней электроны не локализованы по связям N-0' и С-О, вследствие чего структура 2 становится плоской.

Благодаря вращению вокруг связей Са-М и Са-С' полипептидная связь приобретает гибкость, способность сворачиваться в глобулу. Белковые глобулы имеют сферическую или слабо вытянутую форму. Большую часть объема глобулы занимают регулярно встречающиеся элементы вторичной структуры — определенным образом уложенные участки полипептидной цепи, имеющие либо плоскую форму (р-листы), либо форму спирали (сс-спирали). Укладка вторичных структур одной полипептидной цепи в глобулу называется третичной структурой. Взаимодействуя между собой, глобулы могут формировать агрегаты (четвертичная структура).

В состав белков входят остатки 20 канонических аминокислот, 9 из которых имеют неполярные атомные группировки, представленные в основном углеводородными группами. Остальные одиннадцать аминокислот имеют полярные группы СОО, N42, №Н, ОН (как правило, одну из этих групп).

Гидрофобность аминокислот измеряется на опыте по величине констант равновесного распределения аминокислот между водой и слабо полярным растворителем — высокомолекулярным спиртом или диоксаном. На основании этих измерений рассчитывается свободная энергия переноса аминокислот из неполярного растворителя в воду, которая служит мерой их гидрофобности.

Примерно половина аминокислот характеризуются отрицательной свободной энергией переноса, т. е. являются гидрофобными. Величина гидрофобности растет с увеличением доступной для воды поверхности аминокислот, которая в свою очередь увеличивается для крупных аминокислотных остатков (триптофан, фенилаланин). Как правило, аминокислоты с неполярными боковыми группами являются гидрофобными, а если в составе аминокислоты имеется ионогенная группа, то гидрофильными. Однако есть и исключения — треонин и тирозин, имеющие в боковой цепи по одному атому кислорода, а также гистидин, имеющий два атома азота. Так как эти аминокислоты имеют неполярную поверхность, значительно превышающую полярную, они являются гидрофобными.

Полярные аминокислотные остатки на поверхности белковой глобулы образуют водородные связи с молекулами воды. Кроме того, полярные аминокислотные остатки способны завязывать водородные связи и между собой, причем даже в водном окружении. Это возможно потому, что энергетический баланс образования такой связи близок к нулю, а энтропия возрастает.

Сравним ход процесса образования контакта между группой — донором водородной связи и группой-акцептором в вакууме и в водном окружении.

В вакууме состояние «а» с невзаимодействующими группами характеризуется энергией связи Еа = 0 и энтропией 5а = 0. В состоянии «б», при котором образовалась водородная связь между группой-донором и группой-акцептором, энергия равна энергии водородной связи Е6 = Еи, а энтропия по-прежнему равна нулю.

Разница между энергиями в состояниях «а» и «б» равна энергии водородной связи (Еб - Еа = Ен), а между энтропиями — нулю (5а -- 5б = 0). Тогда свободная энергия Е -Е-ТБ в состояниях «а» и «б» различается на величину водородной связи:

В водной среде для состояния «а» характерны энергия Еа = 2ЕН и энтропия Ба = 0. В состоянии «б» Еа =Н, 5б = 5Н, где 5Н — энтропия перемещений и вращения свободного тела, т. е. свободной молекулы Н2 или свободного димера НОН: :ОН2. Изменение свободной энергии системы при переходе из состояния «а» в состояние «б»:

Таким образом, водородные связи полярных групп белков молекулы менее стабильны в водном окружении, чем в вакууме, так как свободная энергия этих связей в окружении воды, равная Т5Н, меньше чем в вакууме, где она равна Ен (энергия водородной связи — величина отрицательная).

Выигрыш свободной энергии при образовании водородных связей в воде, увеличивающий вероятность этого процесса, происходит за счет множественных возможных микросостояний оторвавшихся молекул воды.

Заряжены в молекулах белка могут быть не только полярные группы аминокислотных остатков. Входящие в состав белковой цепи пептидные группы полярны. В целом остов белковой цепи имеет нулевой заряд, но распределение зарядов на его атомах выглядит так, как представлено на рис. 4.2.

Парциальные заряды атомов, составляющих пептидный мостик в молекуле белка

Рис. 4.2. Парциальные заряды атомов, составляющих пептидный мостик в молекуле белка

Пептидные группы, так же как и полярные боковые группы, выступают донорами и акцепторами водородных связей, которые они могут завязывать как друг с другом, так и с молекулами воды.

Конфигурация элементов вторичной структуры белка — сс-спиралей и Р-листов — способствует завязыванию большого количества водородных связей. Так, ос-спираль держится водородными связями, где С = О-группы остова полипептида связаны с МН-группами полярных аминокислотных остатков, входящих в ос-спираль. Внутри Р-структур нет водородных связей, однако они связаны этими связями между собой.

Белковая глобула состоит из гидрофобного ядра, со всех сторон плотно укрытого вытянутыми ос- и ^-структурами, образующими слои. На поверхность глобулы выходят небольшие участки ос- и Р-структур, нерегулярные элементы полипептидной цепи — петли, а также края Р-листов и концы сс-спиралей. Такое строение глобулы обусловлено тем, что расположение гидрофобных групп на поверхности энергетически невыгодно, так же как и наличие полярных заряженных групп внутри глобулы. Поэтому благодаря вращению вокруг связи в пептидных мостиках полярные боковые группы ориентируются так, что они создают гидрофильные поверхности на участках сс-спиралей и Р-листов, выходящих на поверхность глобулы.

Аналогичные сочетания неполярных групп в цепи приводят к образованию гидрофобных областей на противоположных поверхно-46

стях сс-спиралей и ^-структур, обращенных к гидрофобному ядру глобулы. Полярные аминокислотные остатки или атомы пептидного мостика, соединенные водородными связями, могут входить в гидрофобное ядро глобулы, так как эти связи уже насыщены и полярные группы нейтрализовали друг друга. Поэтому в гидрофобное ядро глобулы и примыкающие к нему слои гораздо чаще вовлекаются элементы вторичной структуры с насыщенными водородными связями, чем нерегулярные цепи молекулы петли. Края ^-ЛИСТОВ и а-спиралей содержат свободные от внутримолекулярных водородных связей МН- и СО-группы и поэтому чаще встречаются на поверхности глобулы.

Однако, так как последовательность аминокислот в глобулярных белках носит случайный характер, некоторая часть гидрофобных групп все же выходит на поверхность. Экспериментальные данные о частотах встречаемости аминокислотных остатков в зависимости от характеристики их гидрофобности — свободной энергии переноса из высокомолекулярного спирта в воду — свидетельствуют, что чем более гидрофобна та или иная группа, тем реже она встречается на поверхности. Выходящие на поверхность неполярные группы стремятся завязать между собой гидрофобные контакты или образуют гидрофобные участки, свободная энергия которых меньше, чем сумма свободных энергий отдельных гидрофобных групп, окруженных водой. Так, молекула сс-химотриксина имеет на противоположных сторонах две небольшие гидрофобные области площадью 2—3 нм2 (при общей поверхности глобулы 60 нм2).

Так как полярные группы внутри молекулы часто соединены водородными связями, то на долю незаряженных участков приходится до половины всей поверхности молекулы. Как показывают эксперименты по измерению смачиваемости водой различных белковых поверхностей, молекулы белка на границе с воздухом или иной неполярной средой могут испытывать конформационную перестройку, при которой на поверхность глобулы выходит больше неполярных групп.

Полярные группы белков могут электростатически взаимодействовать и без образования водородной связи — в том случае, если в эти группы не входит частично заряженный атом водорода, или при неблагоприятной для образования водородной связи ориентации групп. При рассмотрении такого взаимодействия необходимо учитывать диэлектрическую проницаемость растворителя — воды. Так как взаимодействующие полярные группы расположены друг от друга на расстояниях, сравнимых с диаметром молекулы воды, следует ожидать, что диэлектрическая проницаемость среды будет отличаться от 80. Специально поставленные эксперименты показали, что эффективная диэлектрическая проницаемость для взаимодействия внесенного в белок мутацией заряда с районом активного центра колебалась от 40 до 120.

Причина относительно небольшого изменения диэлектрической проницаемости — влияние окружающих молекул воды на взаимодействие пары противоположных зарядов.

Заряд, а следовательно, и гидратация полярных групп зависят от pH среды, в которой находится белок. При повышении pH, т. е. падении концентрации Н+, нейтральные группы приобретают отрицательный заряд, а положительно заряженные — разряжаются. При снижении pH благодаря присоединению протона к той или иной полярной группе происходит обратный процесс. Переход из незаряженного в заряженное состояние происходит у разных групп при разных pH, однако ширина перехода при этом всегда одна и та же — около 2 единиц pH (в этом интервале отношение числа заряженных и незаряженных групп меняется от 10:1 до 1:10). Перезаряжаются при изменении pH не только полярные группы аминокислотных остатков, но и Ы-концы пептидной цепи (МН2а), а также ее С-концы (С^-С'ООН). Значения водородного показателя, при котором осуществляется переход из одного зарядового состояния в другое, для разных аминокислот, а также Ы- и С- концов пептидной цепи указаны в табл. 4.1.

Таблица 4.1

Значения pH, при котором происходит смена зарядового состояния

Параметр

Аминокислоты, С- или И-конец пептидной цепи

Азг

С'-СООН

СС1и

НШз

Зарядовое состояние, в котором осуществляется переход при росте pH

00->-1

00->-1

00-»-1

+ 1^0

Средние pH, при которых происходит переход

3,9

33,9

44,3

66,5

Параметр

Аминокислоты, С- или И-конец пептидной цепи

ММН2-С«

Суз

ТТуг

Иле

АА1^

Зарядовое состояние, в котором осуществляется переход при росте pH

+1->0

00->-1

00->-1

+ 1 ->0

+ 1 —> 0

Средние pH, при которых происходит переход

77,7

99,2

110,1

110,5

112,5

Таким образом, заряд белковой молекулы зависит от pH раствора, в котором она находится. Так как на поверхность молекул различных белков выходит разное число каких-либо аминокислотных остатков, каждый белок характеризуется своей изоэлектрической точкой — значением pH, при котором молекула имеет нулевой заряд. Если величина pH выше значения в изоэлектрической точке, то молекула белка имеет отрицательный заряд, если ниже — то положительный. Гидратация белка усиливается при отклонении pH от изоэлектрической точки.

Монослой воды вокруг молекулы белка с молекулярной массой более 15 000 представлен 600—1000 молекулами воды. Времена релаксации по данным ЯМР высокого разрешения отвечают трем типам воды, контактирующей с белком. Первый тип — это «объемная вода», характеризующаяся обычными, известными для воды свойствами с временем релаксации ~10-10 с. Второй тип отвечает «связанной воде» с временем релаксации ~10-9 с и измененной температурой замерзания вследствие образования водородных связей на поверхности молекулы белка. Значительная доля молекул воды образует водородные связи с пептидными группами белка. Вода этого типа не удаляется из белка даже при лиофильной сушке, хотя изотопный обмен свидетельствует об интенсивном обмене этой «связанной воды» с «объемной водой». Таким образом, экспериментальные данные подтверждают представления о возможности обмена водородными связями между свободной водой и «связанной водой» или между водой на поверхности полярной группы белка и другой полярной группой. По данным специальных исследований, содержание связанной воды составляет 0,3—0,5 г на 1 г белка.

Третий тип воды представляет собой еще более прочно связанную воду с потерей вращательных степеней свободы и временем релаксации, характерным для молекулы белка: 10-9—10-7 с. Содержание воды такого типа в белках невелико и не превышает 0,05 г на 1 г белка. Все три типа воды характерны и для белков в кристаллическом состоянии.

Данные по сжимаемости систем с гидрофобными молекулами в ультразвуковом поле показывают следующее. Около 0 °С существует область гидратации вблизи неполярной поверхности, отличающаяся по своей организации от гидратной оболочки иона, но с большей степенью порядка, чем в объеме воды дальше в растворе. Этот локальный порядок легко разрушается при повышении температуры. Если учесть, что основной эффект при удерживании глобулы белка производится гидрофобными взаимодействиями, то из этого факта можно понять явление тепловой денатурации, т. е. разворачивания белковой цепи при достижении определенной температуры.

Изучалась гидратация лизоцима методом ядерного магнитного резонанса. Авторы этого исследования[1] приходят к выводу, что вода сохраняет свойства жидкости на границе с белком, хотя характерные времена вращения и диффузии на порядок больше, чем в объеме. При изучении гидратация лизоцима методом ядерного магнитного резонанса выяснилось, что вода сохраняет свойства жидкости на границе с белком, хотя характерные времена вращения и диффузии на порядок больше, чем в объеме. Результаты, полученные из измерений ядерной магнитной релаксации белков, сводится к следующему. Молекулы воды на поверхности белка могут быстро обмениваться с объемной водой. Любое замедление движения молекул воды обусловлено пространственными затруднениями при их диффузии вблизи поверхности молекулы белка, особенно вблизи полярных групп.

Пониженное содержание связанной воды на поверхности белковой молекулы по сравнению с поверхностью неорганических твердых тел с полярными группами, например А12О3, обусловлено в основном менее плотным расположением полярных групп на поверхности молекулы белка. Действительно, даже в гидрофильных аминокислотных остатках на полярную группу из 2—3 атомов приходится в несколько раз больше атомов, образующих неполярные группы. Все это дает возможность рассматривать заряженные атомные группы как дискретно расположенные заряды на поверхности белковой молекулы. Вокруг заряженных групп может находиться 2—3 слоя связанной воды, что аналогично островному механизму адсорбции. Вода в третьем и частично во втором слое, по-видимому, имеет время релаксации —КН0 с.

Как правило, в пищевых системах молекулы белка окружены водными растворами различных солей. Тогда возле заряженных областей белковой молекулы образуется двойной заряженный слой. В соответствии с теорией двойного слоя (см. подтему 3.3) он состоит из слоя Штерна и слоя Гуи.

Пусть величина pH достаточно далека от изоэлектрической точки, а концентрация ионов не слишком велика. Тогда можно считать, что все полярные группы на поверхности белка имеют одну и ту же полярность заряда, а диффузный слой Гуи характеризуется большой толщиной. Небольшая часть противоионов присоединяется за счет электростатических сил к противоположно заряженным полярным группам, образуя слой Штерна, остальные образуют «облако» вокруг белковой молекулы — диффузный слой Гуи.

Если, например, величину pH раствора снижают за счет добавления НС1, то протоны, соединяясь с карбоксильными группами, компенсируют их отрицательный заряд, а в качестве противоионов выступают ионы хлора. Результирующий заряд белковой молекулы — это суммарный заряд аминокислотных групп, к которым не присоединен ион хлора. Так как молекула в электрическом поле перемещается вместе со слоем Штерна, то заряд д может быть определен, например, при помощи кондуктометрических измерений.

Если одна молекула белка приближается к другой на расстояние г, близкое к диаметру иона хлора, то потенциальную энергию электростатического взаимодействия двух групп на разных молекулах можно найти по формуле

где — заряд участка поверхности одной из молекул, расположенного напротив аналогичного участка другой молекулы с зарядом <32; ?эф — диэлектрическая проницаемость среды (воды), при тесном сближении контактирующих зарядов Еэф = 40. Снижение зарядов и 0.2 противоионами хлора в слое Штерна может привести к агрегации молекул белка.

Если считать, что противоионы образуют «облако» вокруг каждой заряженной полярной группы, потенциальную энергию электростатического взаимодействия заряженных групп можно найти из выражения

где Р — радиус Дебая — Хюккеля, который соответствует характерному размеру противоионного облака вокруг заряда. В воде при комнатной температуре

где

— ионная сила раствора. Сумма берется по всем сортам ионов в растворе, причем 7( — заряд, а С, — концентрация иона г.

  • [1] Брайент Р., Ширли Ч. Результаты изучения гидратированного лизоцима методом ядерного магнитного резонанса // сб. Вода в полимерах. М. : Мир, 1984. С. 149—159.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ     След >