Полная версия

Главная arrow Агропромышленность arrow Общая фитопатология

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>

Отбор проб

Правильный отбор проб — залог успешной идентификации фитопатогенного организма. Для анализа следует брать тот орган растения, в котором находится максимальное количество искомого организма. Так, при идентификации возбудителей корневых гнилей следует брать пораженные корни и прикорневую часть стебля. В листьях, цветках и т.д. возбудителя корневых гнилей, скорее всего, не будет. Даже если поражения других органов наблюдаются, они с высокой вероятностью могут быть вызваны совсем другими патогенами.

При отборе проб следует учитывать и жизненный цикл возбудителя. Возбудитель пыльной головни в латентной форме присутствует в стебле молодого растения. Однако если растение заразилось летом через цветок, то искать возбудителя в стебле бесполезно — его там нет. Успех может принести только исследование цветка. Во всех случаях отбора проб наилучшие результаты диагностики получаются при анализе тканей с границы пораженной и здоровой частей растения.

Особое внимание следует уделять хранению пораженного материала. Лучше всего выделять ДНК из образца как можно быстрее (в течение нескольких часов) после взятия пробы. При длительном хранении в теплых и влажных условиях на образце начнет развиваться сапротрофная микробиота, которая может затруднить выявление причины заболевания. Поэтому при отборе проб для анализа с помощью ПЦР следует по возможности законсервировать образец. Для этого образец можно сразу после взятия пробы заморозить при -20°С, либо поместить в специальный раствор, который препятствует росту микробиоты и деструкции молекулы ДНК. В качестве такого раствора часто используют 70% этиловый спирт. Законсервированный образец можно хранить продолжительное время до начала лабораторных исследований.

Выделение ДНК

Для анализа с помощью ПЦР, или гибридизации ДНК — ДНК по Э. Саузерну (см. параграф 5.5), из исследуемого образца необходимо выделить ДНК (при анализе материала на присутствие вирусов выделяют РНК). В настоящее время существует много методов выделения ДНК, наборов для выделения из различных субстратов, имеются специальные автоматические станции выделения ДНК. На рис. В.7 приведен один из комплектов для выделения ДНК [1] .

Суть всех методов выделения заключается в экстракции ДНК из образца и удалении или инактивации посторонних примесей, мешающих проведению ПЦР. Для того чтобы ДНК вышла в раствор, надо, прежде всего, разрушить клетки. В некоторых случаях (например, при анализе бактерий или клеток животных) достаточно простого кипячения со щелочью, в результате которого разрушаются клеточные стенки.

Однако при работе с грибами, особенно при выделении ДНК напрямую из пораженного органа растения, этого может быть недостаточно, так как гифы гриба и, особенно, споры могут иметь очень прочную оболочку. В этом случае образец растирают пестиком в предварительно простерилизованной фарфоровой ступке.

Для еще большей надежности и увеличения выхода ДНК (что особенно важно, если требуется выделить ДНК патогена, находящегося в пораженном органе в очень малой концентрации) используют жидкий азот. Образец предварительно замораживают и растирают в охлажденной ступке.

Для выделения ДНК из почвы применяют специальные приборы, измельчающие биологический материал почвы в быстро вращающейся головке. Для лучшего разрушения несущих ДНК объектов часто применяют стеклянные шарики или кварцевый песок.

Далее из смеси ДНК с остатками оболочки, неорганическими компонентами (песок, остатки почвы), белками и т.д. необходимо получить очищенный препарат ДНК. Все современные методы очистки нуклеиновых кислот можно разделить на две группы:

— методы с поэтапным удалением примесей из водного раствора;

методы, основанные на сорбции нуклеиновых кислот на твердой фазе.

Из вариантов первого метода наиболее известна экстракция с помощью хлороформа. Метод применим практически для любых видов грибов, может быть использован для выделения из пораженной растительной ткани.

Однако в том случае, если в исследуемом образце много ингибиторов ПЦР, то ДНК необходимо дополнительно очистить на колонке, т.е. применить метод второй группы — сорбировать ДНК на твердой фазе. Обычно очистку проводят в одноразовых пластиковых микроколонках с упакованным в них сорбентом (часто используют оксид кремния или поливинилло- липирролидон (ПВПП)). Промывка колонок растворами с высокой ионной силой удаляет белки и низкомолекулярные соединения, в результате чего на сорбенте остается чистая ДНК. ДНК легко смывается с сорбента растворами с низкой ионной силой, например дистиллированной водой.

Пример

Протокол выделения ДНК для ПЦР

Образец замороженного мицелия залить жидким азотом и растереть в предварительно промороженной ступке. Около 0,25 мл растертого мицелия перенести в микропробирку Eppendorph на 2 мл. В нее добавить 800 мкл лизирующего буфера (СТДВ-буфер). Перемешать на вортексе.

Приготовление СТАВ -буфера (на 1л):

TRIS pH 8,0 100 ммолей;

NaCl 1,4 моля;

EDTA pH 8,0 20 ммолей;

СТАВ (Hexadecyltnmethylammonium bromide) solid 2% (W/V).

После перемешивания микропробирки с мицелием поместить на водяную баню или в твердотельный термостат (65Х) на 1 ч; каждые 20 мин перемешивать на вортексе. Через 1 ч добавить 500 мкл хлороформа (также можно использовать смесь хлороформа и изоамилового или октилового спирта в соотношении 24 : 1), перемешать встряхиванием, центрифугировать 10 мин и перенести 700 мкл верхней фазы супернатанта в новую чистую микропробирку на 1,5 мл. В микропробирку добавить 400 мкл (0,6 объема) изопропанола и ацетат калия (СН3СООК, 1/10 объема, 5 молей, pH = 4,6), перемешать вручную и центрифугировать 10 мин. Супернатант аккуратно слить и промыть осадок охлажденным 70% этанолом. Ценрифугировать 5 мин, слить спирт, удалить его остатки фильтровальной бумагой и высушить осадок в течение 1—2 ч (пока он не станет прозрачным). Ресуспендировать полученную ДНК в 100 мкл ТЕ-буфера или деионизованной воды.

Выделение ДНК обычно проводят в лаборатории, однако при необходимости его можно проводить практически в любом помещении или в мобильной лаборатории. Компания "ДНК-Техиология", например, выпускает портативные лаборатории, позволяющие проводить выделение ДНК и ПЦР-диагностику, упакованные в переносной кейс (рис. В.8) [2].

  • [1] URRL: wvw.isohelix.com (дата обращения: 20.08.2015)
  • [2] URL: clna-technology.ru (дата обращения: 20.08.2015).
 
<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>