Оборудование для Real-Time PCR

Real-Time PCR проводят в ПЦР- амплификаторе, снабженном устройством для освещения пробирок светом с длиной волны, возбуждающим флуоресценцию, и многоканальным флуоресцентным детектором, позволяющим измерять уровень флуоресценции в каждой пробирке непосредственно в ходе ПЦР (детектирующий амплификатор, рис. В.18) [1].

В большинстве аппаратов нагрев и охлаждение термоблока обеспечиваются работой элемента Пельтье, однако само наличие термоблока затрудняет установку световой аппаратуры (освещение пробирки и детекция сигнала возможны только в вертикальном положении — через дно пробирки и крышку, что не очень удобно и снижает точность измерений). Поэтому некоторые производители полностью отказываются от термоблока и применяют обдув пробирок термостатированным воздухом. В термоциклерах такой конструкции пробирки обычно помещают во вращающемся роторе. Отсутствие термоблока позволяет проводить измерения через боковые поверхности пробирки, что повышает их точность.

При идентификации патогенных объектов часто проба конструируется таким образом, чтобы одновременно можно было выявлять несколько объектов. В этом случае используется сразу несколько флуорофоров в одной пробирке, и необходимо согласование оптической части прибора со спектральными характеристиками всех используемых флуорофоров.

Оптическая часть прибора должна обеспечивать и оптическую фильтрацию, т.е. отсекать возбуждающий свет от флуоресценции. Во всех современных устройствах эта задача решается при помощи оптических интерференционных фильтров. Фильтры устанавливаются между источником света и пробиркой с пробой и флуорофором, а также между пробиркой и приемником сигнала.

В оптических блоках современных детектирующих амплификаторов используют различные источники света — лазеры, светодиоды, галогеновые лампы накаливания.

Лазеры мало применяются из-за высокой стоимости и короткого срока службы.

Наиболее популярны схемы на основе галогеновых ламп накаливания, поскольку они дешевы, имеют широкий спектр излучения, который позволяет выделять свет возбуждения практически с любыми характеристиками. Основными недостатками ламп являются небольшой срок службы, значительное тепловыделение, невысокие энергетические характеристики потока возбуждения (так как при формировании узкого спектра используется очень малая часть световой энергии).

Более перспективны в качестве источников света светодиоды, так как они имеют большой срок службы, высокий КПД (коэффициент полезного действия), малый нагрев и узкий спектр испускаемого света. Однако очень узкий спектр является и недостатком — он не позволяет конструировать многоканальные системы, рассчитанные на одновременную работу с несколькими флуорофорами.

В качестве детекторов испускаемого флуоресцентного излучения наиболее широко применяются приборы с зарядовой связью (ПЗС-матрицы; рис. В. 19). Эти же матрицы используют в фото- и видеоаппаратуре. В детектирующих амплификаторах ПЗС-матрицы позволяют одновременно детектировать сигнал от нескольких флуорофоров с разными длинами волн. Большая ПЗС-матрица предоставляет возможность одновременно детектировать сигнал в нескольких (и даже во всех) образцах. Это разрешает легко увеличивать число образцов в термоблоке — в современных аппаратах их число доходит до 1536. Наилучшие показатели обеспечивают матрицы со сравнительно небольшим числом пикселей.

Большинство современных детектирующих амплификаторов проводят реакцию в стандартных пробирках или плашках. Амплификаторы фирмы Lumex предполагают проведение анализов на специальных чипах. На одном чипе может быть закреплено до 48 (на рис. В.20 [2] показан чип на 16 проб) разных тест-систем (праймеры + проба). Если нанести на чип ДНК исследуемой пробы, то сразу можно провести анализ па наличие большого числа патогенных организмов, что очень удобно. При этом анализ получается довольно дешевым благодаря очень малому объему реакционной смеси (1,5 мкл). Для сравнения, объем смеси в пробирке или в ячейке плашки обычно составляет не менее 25 мкл.

  • [1] URL: bio-rad.com (дата обращения: 20.08.2015).
  • [2] URL: lumexinstruments.ca (дата обращения: 20.08.2015).
 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >