Организация ПЦР-лаборатории

Все методы, связанные с ПЦР, отличаются очень высокой чувствительностью. Для прохождения реакции и получения регистрируемого ПЦР-продукта достаточно не только одной клетки, но даже ядра или единственной матричной молекулы. Это накладывает довольно жесткие требования на организацию труда в ПІЦ5-лаборатории. Если лабораторное оборудование, реактивы, одежда или воздух будут загрязнены продуктами предыдущих реакций, то это может привести к получению некорректных результатов в дальнейших исследованиях. Особенно это касается тех лабораторий, в которых проводятся массовые исследования с одними и теми же праймерами (например, выявление карантинных объектов или сертификация семенного материала). Во избежание загрязнения продуктов реакции ампликонами и получения ложноположительных результатов следует соблюдать ряд требований:

  • 1) прием образцов для диагностики, выделение и очистка ДНК, приготовление смесей и проведение ПЦР и анализ продуктов амплификации (с помощью электрофореза) должны проводиться в разных изолированных друг от друга помещениях;
  • 2) для каждого из вышеперечисленных помещений должны быть свои наборы дозаторов и реактивов. Необходимо избегать перемещения оборудования из одного помещения в другое;
  • 3) желательно проводить операции в разных помещениях силами разных сотрудников. При выполнении всех этапов одним сотрудником разбор пораженных образцов и проведение электрофореза должны проводиться в конце рабочего дня;
  • 4) очистку ДНК и приготовление смесей для ПЦР желательно проводить в ПЦР-боксах без включения воздушного потока. В перерывах между работой в боксах следует включать ультрафиолетовые облучатели;
  • 5) каждый процесс следует проводить в новых одноразовых перчатках без талька, использовать новые стерильные наконечники (желательно с фильтром) и микропробирки с маркировкой "DNAse and RNAsc free";
  • 6) в эксперименты необходимо включать контрольные реакции: отрицательный контрольный образец (в котором есть все, кроме матричной ДНК) и положительный контрольный образец (в нем есть все реактивы, но другие праймеры), в котором реакция должна пройти обязательно. Наличие продуктов амплификации в отрицательном контрольном образце свидетельствует о загрязнении оборудования или реактивов продуктами ПЦР предыдущих исследований. Отсутствие ПЦР-продукта в положительном контроле свидетельствует об ошибках в постановке или проведении реакции, либо об испорченных реактивах.

Методы идентификации с помощью ПЦР широко применяют для практических целей в фитопатологии. Они позволяет быстро и точно определить возбудителей опасных заболеваний, карантинные и токсинообразующие организмы в самых разных субстратах. Немаловажно и то обстоятельство, что для ПЦР можно довольно быстро разрабатывать праймеры и тест- системы, что позволяет успешно выявлять новые штаммы возбудителей, не поддающиеся идентификации другими методами.

Метод ПЦР в реальном времени относительно прост в исполнении и не требует больших временных затрат. В некоторых случаях проведение анализа возможно даже в поле. Процесс анализа полностью автоматизирован, что позволяет проверять большое количество образцов в одном эксперименте.

 
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ     След >